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解决方案
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“解放双手”之Online SPE-HPLC技术在药物分析中的应用
发布:赛默飞色谱与质谱中国浏览次数:402固相萃取(Solid Phase Extraction,简称SPE)技术是当前各大实验室最常用的样品前处理技术之一,相对传统的液-液萃取技术,SPE是采用固体色谱填料对目标成分进行富集,或将其复杂基质净化,减少后续分析分离的干扰。在线固相萃取-液相色谱系统(Online SPE-HPLC)将样品前处理与成分分析分离整合在一起,交由液相自动完成活化、平衡、净化、洗脱、检测等全流程,在线固相萃取色谱柱可以重复清洗使用,检测过程中可显著减少样品使用量与溶剂消耗量,减少人工操作引入误差与偏差,适合用于批量样品快速分析,分析效率极大提升,完全满足分析实验室健康绿色、降本增效的发展理念。
赛默飞双三元液相色谱系统,采用独特的双泵设计,每个泵可作为一个单独的运行体系,有各自独立的比例阀和流动相体系,可同时分别控制三条流动相流路,结合柱温箱在线阀切换技术,通过灵活且成熟的流路连接设计,一套系统即可以轻松实现Online SPE以及HPLC分离过程,此外,还可以升级成为更多高级应用,如:中心切割二维液相色谱法等。软件方面,使用Chromeleon™ 色谱数据管理系统,就可以实现一站式方法建立,轻松开启Online SPE-HPLC等分析流程。
图1:双三元梯度泵外观图
图2:Online SPE-HPLC流路图(反冲模式,黄色:分析流路;蓝色:上样流路)
图3:阀切换示意图(例:反冲模式)
一、化药
使用反相固相萃取柱的Online SPE-HPLC应用案例:
以复 方甘草片中的吗 啡成分测试为例,在2020版药典中吗 啡含量测定需要进行离线固相萃取,操作流程繁琐,耗时较长,且易造成目标成分的损失,将该前处理方法转换成Online SPE方法,即可实现快速、高效的富集与净化,并直接转入分析色谱柱,取得更准确的含量测定结果。此案例从Ultimate 3000文献报道方法[1]向Vanquish HPLC实现成功转移,使用RP C18小柱(10mm)作SPE柱,方法简单,重复使用,性价比很高。
色谱条件设置:
色谱分析结果:
二、中药
反相或离子交换固相萃取柱的Online SPE-HPLC应用案例:
中药成分复杂多样,色谱分析一直存在些许挑战,尤其是复 方制剂中的活性成分含量测定,影响因素更多,其首要因素在于基质干扰更明显。利用赛默飞双三元液相色谱系统,采用在线固相萃取技术的柱切换净化方法结合电雾式检测器CAD检测,对样品进行净化(Acclaim PA2 column,3μm,4.6×50mm,PN:063189)后再自动切换到分析柱(Acclaim C18 column,5μm,4.6×150mm,PN:059148)上进行分析,取得了很好的结果。已成功应用于黄芪药材、归脾丸(浓缩丸),补肾固齿丸,益气养血口服液和颈复康颗粒等中药复 方样品的分析中[2]。
此外,选择合适填料的固相萃取柱,对生物碱的保留与峰形优化均有益处,下面的案例中采用涡流色谱MCX阳离子交换柱(Turboflow HTLC MCX-2 column,1.0×50mm,PN:CH-953456)富集以小檗碱为代表的6种异喹啉类生物碱,在线去除复杂基质干扰后,经分析柱(Acclaim C18 column,3μm,4.6×150mm,PN:059133)完成准确的含量测定,该方法普适性较好,可适用于黄连、黄柏及多种包含这两味药材的复 方制剂[3]。
Online SPE-HPLC-CAD联用测定黄芪及其复 方中黄芪甲苷的含量色谱图[2]:
Online SPE用于生物碱富集前后的色谱图表现(1号峰:黄柏碱)[3]:
三、生物药
Online SPE技术用于蛋白样本脱盐后进质谱分析的应用案例:
使用Vanquish UHPLC系统Online SPE平台对复杂的生物制药样品表征十分有帮助,且易于与高分辨质谱平台(Q Exactive HF等)进行整合,Vanquish Flex液相标配生物兼容体系,在蛋白、核酸等生物大分子分析领域应用广泛。为了保证蛋白药物的稳定性,制剂配方中往往需要加入缓冲盐溶液,但是高浓度非挥发性缓冲盐的存在,可能对质谱喷雾阶段产生影响而不能直接进样分析,需要进行样本脱盐操作,与花费大量时间、劳动的手动离线SPE相比,采用Vanquish Online SPE-2DLC用于质谱前端,方法更快,更不易出错。LC-MS系统可由Chromeleon™ CDS全面控制,满足GMP/GLP要求,是完全集成和自动化样品处理的“交钥匙”解决方案。
SPE柱温度设置对蛋白分离度的影响[4]:
质谱检测混合蛋白样品的分子量结果[4]:
四、小结
赛默飞Vanquish双三元液相色谱是创新型液相色谱系统的代表之一,凭借其智能、高效、科学的特点,全面支持分析工作者的高级方法开发与应用。其中,赛默飞Online SPE-HPLC技术已经在药物研究、环境化学、食品饮料等多个领域广泛应用,针对目标物特性,灵活选择赛默飞多种不同的化学键合相的SPE柱与分析柱,让样品前处理不再成为色谱质谱分析的“卡脖子”难题。
参考文献:
[1] 杨艳羚,李效宽,李玉桑,刘敏,奉黎静,唐和斌.在线固相萃取-HPLC测定复 方甘草片中吗 啡的含量[J].药物分析杂志,2013,33(11):1920-1923.DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.11.016.
[2] 李效宽,张艳海,冯天辉,杨艳羚,金燕.在线固相萃取法结合电雾式检测器测定黄芪及其复 方中黄芪甲苷的含量[J].分析化学,2014,42(12):1791-1796.
[3] Yuangui Yang, Lvye Liu, Zhengtao Wang, Yan Jin & Yanhai Zhang (2022):Simultaneous Determination of Protoberberine Alkaloids Derived from Coptidis Rhizoma and Phellodendri Cortex in Pharmaceuticals by On-line Solid-Phase Extraction (SPE)—HighPerformance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection (HPLC-UV), Analytical Letters, DOI:10.1080/00032719.2022.2125525
[4] TN NO .184, A pre-concentration and online solid phase extraction setup for the LC-MS analysis of therapeutic protein mixtures, http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TN-184-SPE-LC-MS-Therapeutic-Protein-TN72161-EN.pdf
2023-05-30相关仪器 -
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