用光检测,用心计量—实时定量PCR仪荧光检测系统

    荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR反应过程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这一技术特异性强，自动化程度高，且有效地解决了PCR污染。因此，实时荧光定量PCR仪逐步取代普通PCR仪在临床检验、检验检疫、法医鉴定、疾病控制、体外诊断试剂制造和研发、生物技术产品研发等领域得到了为广泛的应用。
    荧光定量PCR仪在普通PCR仪的技术上增加了荧光激发装置和检测系统，包含激发光光源，滤光片，镜头和荧光检测器等。温度与光学系统共同对荧光定量PCR仪的性能起到决定性控制作用，共同决定终实验结果的准确性和可靠性。因此，对PCR仪的校准需求也逐步从单纯的温场校准转向温度加荧光的复合参数校准。
    影响荧光定量PCR仪荧光信号量的主要因素包含化学试剂、PCR仪模块的温度因数、PCR仪顶盖温度因数、镜头，反光镜和光路通道、荧光接收器的敏感度、PCR仪机械组成部分、荧光信号处理软件的阈值设定，如基线，基线设定，S/N比例探测等。
    但是医院使用生物试剂测试盘这种检测方法和采用已知浓度的质粒DNA标准物质对样本线性误差进行校准的方法都属于化学方法，这种用化学方法来对物理现象进行校准的方法，严格上将存在缺陷，仅能够针对孔与孔间的组合线性进行测量，所得结果仅能代表PCR仪孔与孔间的平均结果，不能代表单孔的线性，无法真实反映仪器的性能。且无法溯源到任何公认的标准，并无法说明荧光定量PCR仪的温度和荧光对定量PCR结果的联系和影响，误差来源等。
    加科学的方法应该采用可溯源物理手段同时对荧光定量PCR仪的温度部分和光学部分进行校准，并分析二者之间的联系。
    为了满足客户需求，引入了Cyclertest 3D optical 定量PCR仪荧光校准系统。系统在原有的PCR仪温度校准系统基础上运用可溯源光谱理论，使荧光探头产生不同强度的荧光，将温度和荧光检测相结合，模拟荧光定量PCR仪试验，不仅可以对温度模块、上盖温度进行检测，还能同时对荧光系统进行检测，并分析而二者的相关性。
    温度部分可以对PCR仪的温度度、空间温差、实时升温速率、实时降温速率、温度过冲、温度持续时间、上盖温度进行校准。荧光部分不仅可以避免光谱的漂移，用物理手段对荧光系统的线性进行检测，地解决了标准物质化学手段无法测量单孔线性的问题。还可以对荧光定量PCR仪的Cq（Ct）相差值，度，荧光饱和值，荧光线性，熔解曲线度及一致性，熔解温度的比例关系及线性灵敏度等进行检测。
    Cq（Ct）值直接关系到荧光定量PCR仪的定量准确度，并可用来判断PCR仪的孔间一致性。
    通过对荧光强度的线性递减过程进行控制，可以对荧光单孔的线性和线性灵敏度进行检测。
    熔解曲线可反应PCR扩增过程中随着温度升高DNA双螺旋结构的降解程度，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的熔解温度（Tm值）上有一特征峰，利用不同熔解温度对应的特征峰的不同可将特异产物与其它产物分开。熔解曲线度及一致性可判断荧光检测系统是否存在光路通道差异，荧光接收差异和荧光检测灵敏度差异等。熔解温度比例可判断漂移产生的原因来源是光学系统还是温度系统。
    峰值间相差值与孔间温度差异一直，样品为同一样品，引起熔解曲线漂移的原因是温度孔间温差。
    近几年，实时定量PCR仪已经逐步取代普通PCR仪，基因检测由此迎来了新的时代，这对计量人而言，是挑战，但是机遇，技术从不止步，计量人也从不停歇。

                                                                                                             （本文内容来源于网络，如有侵权请联系我们删除）