双荧光素酶报告基因检测（二）

        双荧光素酶实验通常被用来评估miRNA是否与其潜在的靶基因发生相互作用。实验中，预测的miRNA靶标基因的3’-UTR序列被克隆到含有萤火虫荧光素酶的报告基因载体的3’-UTR位置。如果miRNA与插入到质粒中的目标序列发生结合，miRNA将通过抑制该序列的翻译来降低萤火虫荧光素酶的表达，进而导致荧光强度的下降。这一变化可以作为miRNA与靶基因结合的指标。

 miRNA简介

        microRNA（miRNA）是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子，它并不编码蛋白质，因此 miRNA与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编码 RNA。通过参与调节其下游基因翻译过程面发挥其生物学功能。

       miRNA的功能机制与siRNA相似，主要通过与靶RNA的碱基形成互补配对，从而导致RNA诱导的沉默复合体（RISC）介导的RNA降解或阻止mRNA被翻译成蛋白。区别在于，miRNA通常与mRNA的3'UTR区域发生结合。

miRNA与靶基因的作用机制

       通过将miRNA靶基因的结合位点构建到荧光素酶报告载体系统里，同时和miRNA寡核苷酸转染，观察荧光的强度变化，来判断miRNA是否作用了靶基因。miRNA 的基本作用机制有两种：1. 抑制蛋白翻译miRNA 能以 4 种不同的方式抑制蛋白质表达：(1) 使正在翻译的蛋白发生降解；(2) 抑制翻译延伸；(3) 使翻译过早终止（使核糖体从 RNA 上提早掉下来，没法行使翻译功能）；(4) 抑制翻译起始。2. 通过不完全的 miRNA-mRNA 互补配对诱导靶 RNA 降解。由于 miRNA 的作用机制是比较复杂的，所以我们在检测 miRNA 作用的时候，不光要检测一下它的靶基因的 RNA 水平的表达，还要检测一下靶基因的蛋白表达。

图1载体构造与miRNA与靶基因的作用机制 (DOI：10.3892/or.2018.6944)

 miRNA与靶基因的作用实验步骤

        通过实验原理我们知道对于miRNA靶基因验证实验我们需要构建的转染工具有：（1）对于miRNA有miRNA对照组（miRNA-NC）和miRNA过表达（miRNA）；（2）对于靶基因的3’UTR有3’UTR空载对照组（3’UTR-NC），3’UTR野生型（3’UTR-WT），3’UTR突变型（3’UTR-Mut）。一般是按照如下分为六组（已用序号标明）。

1. microRNA靶点的预测

利用Targetscan,miRDB,PicTar软件预测靶基因3’UTR与microRNA的结合位点。

2. 构建含靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体

根据软件预测的靶基因3’UTR与microRNA的结合位点，设计引物PCR扩增靶基因3’UTR序列，或直接进行基因合成，再插入到双荧光素酶报告基因载体上。

3.microRNA mimics和 microRNA negativecontrol的合成

合成相应的microRNA mimics和 microRNA negativecontrol.

4.细胞转染准备

将靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体和microRNA mimics或microRNA negativecontrol共转染293T或Hela细胞。

5.荧光素酶检测

共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。

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     我们从以下案例来分析：

案例

      我们以MicroRNA-1269b inhibits gastric cancer development through regulating methyltransferase-like 3 (METTL3)来分析。

       MicroRNA（miRNA）表达失调与许多肿瘤的进展有关，据报道，miR-1269b的异常表达在某些癌症的进展中起着关键作用，研究旨在研究miR-1269b在胃癌（GC）进展中的作用及其隐藏机制。

       METTL3是GC细胞中miR-1269b的下游靶标，通过StarBase在线分析数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)，发现miR-1269b和METTL3 mRNA 3-UTR之间存在结合位点（图3A）

双荧光素酶报告分析强调miR-1269b过表达可以降低293T细胞中METTL3-WT的萤光素酶活性， 但METTL3-MUT的表达没有受到显著影响，qRT-PCR和Western印迹表明，与对照（miR-NC或miR-in）相比，miR-1269b过表达显著降低了NCI-N87细胞中METTL3 mRNA和蛋白质的表达，而miR-1269b抑制剂转染SNU-16细胞的作用相反（图3C和D）。通过qRT-PCR，我们还发现METTL3在GC组织中的表达明显高于邻近组织（图3E）。相关性分析强调，miR-1269b的表达与GC组织中METTL3 mRNA的表达呈负相关（图3F）。上述结果表明，miR1269b可以靶向METTL3mRNA 3-UTR，并负调控GC细胞中METTL3的表达。

Fig.1  METTL3 is the target of miR-1269b A) The predicted binding sequence between METTL3 mRNA 3UTR and miR-1269b. (b) Dual-luciferase reporter gene assay was used to verify the binding relationship between METLL3 mRNA 3 UTR and miR-1269b.(c) and (d) qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of METTL3 mRNA and protein in NCI-N87 and SNU-16 cells transfected with miR-1269b mimics or inhibitors. (e) qRT-PCR was used to detect the expression of METTL3 mRNA in GC tissues and adjacent tissues. (f) Pearson correlation was used to analyze the correlation between METTL3 mRNA expression and miR-1269b expression in GC tissues. **P < 0.01, and ***P < 0.0

        这张图片主要内容为验证miR-1269b和靶基因METTL3互作。图a：StarBase进行生物信息学分析靶基因的3’-UTR区序列是否有miRNA结合位点；图b：双荧光素酶报告基因实验；图c和d：qRT-PCR和WB检测miR-1269b对靶基因METTL3 mRNA和 蛋白表达水平的影响；图f：相关性分析miRNA-1269b和靶基因METTL3之间的关系。

      接着，我们又对以下的文献进行分析，Hepatocyte-specific suppression of microRNA-221-3p mitigates liver fibrosis，主要为miR-221-3p结合Gnai基因3’UTR区调节HSCs细胞活化影响肝纤维化。

       miR-221-3p通过GNAI2抑制了HSCs的激活，慢性肝损伤期间，阻断肝细胞中的miRNA-221-3p功能有助于肝脏的恢复和更快地解决细胞外基质的沉积问题。此外，作者证明，miRNA-221-3p对GNAI2具有转录后调控作用，导致C–C motif趋化因子配体2的分泌减少，从而减轻了肝纤维化。miRNA-221-3p的抑制可作为改善肝纤维化的方法之一。

      通过生物信息学分析以及相关软件预测，获得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2（A）。WB和qPCR结果显示，与健康组相比GNAI2的表达水平较低（B)，与Control相比，AAV Tud组GNAI2表达水平提高（C，D），这可能与miR-221-3p的上调有关。之后用miR-221-3p mimics处理正常肝细胞，结果显示，与阴性对照组相比，miR-221-3p mimics处理组的GNAI2表达水平显著降低（E）。双荧光素酶实验结果进一步证明了miR-221-3p mimics直接靶向Gnai2的3’UTR。综上，作者证明miR-221-3p直接参与Gnai2的转录后调控。

Fig. 1 Gnai2 is a novel target gene of miR-221-3p. (A) A 30 UTR sequence of Gnai2 targeted by miR-221-3p. (B) GNAI2 is significantly downregulated in

primary hepatocytes isolated from fibrotic liver tissues in vivo. AAV TuD injection leads to upregulation of Gnai2 (C) mRNA and (D) protein levels in isolated primary hepatocytes (n = 7 mice/group). (E) Transfection of miR-221-3p mimic in primary hepatocytes leads to a decrease in GNAI2 protein levels compared with respective scramble control (n = 5). (F) Dual luciferase reporter assay shows that miR-221-3p directly binds to 30 UTR of Gnai2, suggesting that Gnai2 is a direct target of miR-221-3p. Data are shown as fold change and compared with the control group set as 1. Error bars represent ± SEM. One-way ANOVA was used for statistical evaluation. (*p <0.05). AAV, adeno-associated virus; RLU, relative luminescence units (n = 4); Scr, scramble control; TuD, Tough Decoy; UTR, untranslated region.

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