荧光原位杂交——卡梅德生物

       荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术基于与任何DNA杂交方法相同的原理，该方法利用单链DNA与互补DNA退火的能力。在FISH的情况下，靶DNA可以是中期染色体、间期细胞核或组织切片，附着在玻璃显微镜载玻片上。FISH的出现代表了细胞遗传学领域的重要一步，现已被广泛用于研究和诊断。FISH相对于其他原位杂交方法（放射性或免疫细胞化学）的优势主要是由于显著提高了速度和空间分辨率。除此之外，标记的探针是稳定的，可以长期储存，并且不再需要中期染色体上非特异性信号的统计分析[1]。

  一．荧光原位杂交的关键步骤

1.变性寡核苷酸引物（DOP）-PCR法合成DNA探针

         该方法主要用于大基因组区域的扩增和标记，以生产全染色体涂料（WCP）或部分染色体涂料（PCP）。模板通常是流动分选的染色体或染色体微区。该技术包括两轮不同的PCR：第一轮允许扩增染色体DNA，而第二轮允许掺入标记的核苷酸。

（1）第一轮PCR（扩增）：在0.5 mL无菌离心管中，混合10×DOP-PCR缓冲液、核苷酸混合物（dATP、dCTP和dGTP）、dTTP（2mM），DOP PCR引物（20μM）、Taq Supreme聚合酶（2.5个单位）、500条染色体或染色体片段（通常重悬于2μL中），和DNase游离dd H2O，最终体积为100μL。

（2）PCR设置：在94°C下进行9分钟的初始变性步骤，然后进行30个循环（在94°C下1min，在62°C下1.5min，在68°C下进行8min），最后将温度保持在4°C。

（3）使用凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）以检查DNA扩增是否发生。

（4）第二轮PCR（标记）：在5 mL无菌离心管中，混合10×DOP-PCR缓冲液、核苷酸混合物（dATP、dCTP和dGTP各2 mM）、dTTP（2 mM），无DNA酶dd-H2O，最终体积为100μL。

（5）PCR程序设置于（2）相同。

（6）标记的PCR产物的大小应通过1%琼脂糖凝胶上的电泳检查（DNA片段的预期大小应为200–600 bp）。理想情况下，获得的标记DNA的平均产量应约为20–50ng/μL。

（7）标记的PCR产物在使用前应储存在−20°C下。

2. 荧光原位杂交

（1）将12μL变性杂交混合物（包含与杂交缓冲液混合的探针）滴在每张载玻片上。

（2）盖上22×22mm的盖玻片（避免气泡），并用橡胶溶液密封盖玻片。

（3）将载玻片放置在潮湿的室内，并使其在42°C的水浴中漂浮过夜，或放置在42°C的培养箱中。

（4）轻轻地取出橡胶溶液，避免盖玻片移动，这可能会导致染色体和细胞核受损。

（5）在摇晃的平台上，用装有2×SSC的Coplin罐清洗载玻片5 min，以去除覆盖物。

（6）为了去除未结合或非特异性结合的探针片段，将在严格的条件下清洗载玻片。

（7）将载玻片放入装有0.4×SSC的预热Coplin罐中，在70°C下放置5分钟。

（8）将载玻片在含有2×SSC的Coplin罐中于室温下在摇动平台上转移5分钟。

二．FISH中常用的荧光染料[2]

三．荧光原位杂交（FISH）技术的发展[3]

      3.1 Tyr-FISH：信号放大技术是使用过氧化物酶偶联抗体作为信号检测的第一层，然后使用荧光染料标记的酰胺作为过氧化物酶底物，在原位结合过氧化物酶附近生成并沉积许多荧光染料。使用该信号方法系统，FISH的灵敏度可提高10-100倍。然而，任何信号放大系统也有可能显著增强背景信号，需要不断调整达到适合的信噪比[4]。

     3.2 使用光学切片显微镜的三维FISH：减数分裂细胞被轻轻固定在旨在保护染色体结构的缓冲液中。然后花粉母细胞从固定的花药中轻轻挤出，并嵌入光学透明的聚丙烯酰胺中进行染色和成像。FISH图像的堆叠被拍摄并组合成一个单一的三维图像。携带FISH信号的个体染色体可以被追踪和计算拉直。该技术可以很好地保存染色体结构，因此该技术的优点是可以精确定位细胞核内染色体上的DNA探针。三维FISH系统在定位染色体上的DNA探针方面没有主要优势，但由于其温和的固定过程有利于染色质结构的保存，在研究细胞核内DNA序列的空间组织和免疫分析中检测蛋白质方面是有价值的[5]。

       3.3 超延伸染色体上的FISH：在有丝分裂中期，经过温和的蛋白酶K消化后，在流动分选的植物染色体可以被拉伸到原来大小的100倍以上。拉伸染色体上的FISH显示比未经处理的对照更亮的信号，这可能是由于探针更容易接近拉伸的染色质。超延伸中期染色体上的FISH图谱分辨率高达70kb，与减数分裂粗线染色体的分辨率相似[6]。

      3.4 FISH作为染色体鉴定的工具：许多重复的DNA元件在单个染色体上产生特定的FISH信号模式。如来自单个重复DNA探针的FISH信号不能提供足够的信息来区分每条染色体，则可以标记两个或多个重复DNA探针的组合以增加分辨率。例如，来自两个重复DNA探针的FISH信号允许鉴定六倍体小麦的所有21条染色体。使用重复DNA探针的一个潜在缺点是FISH信号模式在不同品种和材料之间的多态性，特别是对于开放授粉的植物物种[7]。

      作为基于重复序列的FISH探针的替代方案，染色体特异性细胞遗传学DNA标记（CSCDM）可以使用大插入基因组DNA克隆（如BACs）来开发单个染色体。可以开发一组CSCDM来产生独特的FISH信号模式，允许识别所有染色体。Kim等[8]人使用一组22个BAC基因克隆同时鉴定所有10条高粱染色体。BACs可以通过DNA标记在遗传连锁群上进行分离。因此，通过CSCDM鉴定的染色体可以与遗传连锁群整合。

       3.5 基于FISH的核型和系统发育分析：基于FISH的染色体鉴定系统可用于核型分析。例如：几个重复的DNA探针在小麦及其相关物种的染色体上产生特定的杂交模式。来自这些探针的FISH信号模式为每个物种产生了独特而稳定的FISH核型[8]。

      卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)积累了丰富的荧光原位杂交技术服务经验，搭建了完备的FISH技术服务平台，我们能够提供包括从探针设计、样本处理、杂交检测、基因表达研究到数据分析等一站式FISH技术服务。

参考文献：

[1] Christine,E,Fuller,et al.Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) in Diagnostic and Investigative Neuropathology[J].Brain Pathology, 2006.DOI:10.1111/j.1750-3639.2002.tb00424.x.

[2] Pernthaler A , Pernthaler J , Amann R .Fluorescence In Situ Hybridization and Catalyzed Reporter Deposition for the Identification of Marine Bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology, 2002.DOI:10.1007/s10800-010-0082-1.

[3] Jiang J, Gill B S. Current status and the future of fluorescence in situ hybridization (FISH) in plant genome research[J]. Genome, 2006, 49(9): 1057-1068.

[4] Speicher M R , Ballard S G , Ward D C .Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH[J].Nature Genetics, 1996.DOI:10.1038/ng0496-368.

[5] Rencheng Y U , Xianghai T , Qingchun Z ,et al.Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method to detect "tamarense/catenella species complex" ("Temperate Asian" ribotype) in Genus Alexandrium along Chinese coast[J].Acta Scientiae Circumstantiae, 2006.

[6] Natarajan A T .Fluorescence in situ hybridization (FISH) in genetic toxicology.[J].Cheminform, 2010, 33(41):291-291.

[7] Szeles A .Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the molecular cytogenetics of cancer[J].Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 2002, 49(1):69-80.

[8] Wei H J , Su T H , Chien C L ,et al.Fluorescence in situ hybridization (FISH) as a method to detect aneuploid cells.[J].Fetal Diagnosis & Therapy, 1997, 12(5):309-313.

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