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你想知道的荧光定量Western上样量解答来啦
发布:艾普拜生物科技(苏州)有限公司浏览次数:330荧光定量Western Blot,不是上样量越多越好。可靠的Western Blot印迹数据通过加载适当量的样品才能获得。加载过多的蛋白会导致信号饱和或用于检测的荧光基团的自猝灭。
那么,您如何知道要加载多少裂解液呢?使用BCA或Bradford等蛋白测定方法测量裂解液样品的浓度。一旦知道样品的浓度,便可以确保每种样品的加载量相同。
于此同时,您仍然需要一种方法来校准凝胶加载量和转印效率的问题。蛋白印迹定量的方法和共识是将蛋白进行归一化。许多期刊都接受了总蛋白质归一化(TPN),有些期刊(例如《JBC》)甚至要求作者在Western印迹的定量数据时使用TPN或使用验证过的看家蛋白进行归一化。
在下面的实验中,加载了0.2-50µg的HeLa裂解物,以检测靶标蛋白STAT3与内参对照GAPDH和总蛋白膜染色的性能。尽管Total-PVDF膜染色线性ZG至50μg裂解物,但这显然不是靶标蛋白STAT3加载的理想上样量,因为信号在12.5μg以上不再线性。上样控制GAPDH的归一化提出了一个严重的问题,因为它在裂解物的浓度低于1µg时呈线性,因此其定量用途非常有限。
一般而言,我们建议不要加入超过20µg的裂解物,因为这通常会导致蛋白定量方面的问题。为了获得荧光定量Western印迹,不要忘记应用适当的归一化策略并加载适量的蛋白。
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2021-02-22相关仪器 -
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