组织透明化与点击化学相结合的新技术CATCH

在完整组织中观察药物靶点相互作用的工具一直是理解体内药物作用的主要障碍。2022年发表在Cell上的题为“Insitu identification of cellular drug targets in mammalian tissue”的文章有突破性进展，作者通过修改和整合点击化学（CC）与组织透明化技术，开发了一种方法——透明辅助组织点击化学（Clearing-Assisted Tissue Click Chemistry，简称CATCH），允许小分子药物-靶点相互作用在亚细胞分辨率下进行标记和成像(图1A)。该技术为组织中小分子的体内相互作用可视化提供了一个有价值的平台，并能够识别药物在哺乳动物组织中的分布和参与。

图1 CATCH技术的方法开发

1.组织透明化极大地改善了哺乳动物组织中的化学标记

作者对小鼠给药脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）缓聚剂PF7845-yne（末端含炔基），通过CuAAC点击化学反应，炔基与荧光标签的叠氮化物反应形成叠氮炔环，进而引入荧光基团。初始试图直接成像药物结合的FAAH，但由于信噪比较差，未能显示细胞靶标。因而猜测脑组织构成复杂，其致密的脂膜可能影响点击化学反应，作者测试了基于聚丙烯酰胺的水凝胶组织透明化方法CLARITY，结果发现去除脂质后显著提升了成像的信噪比（图1C、D）。作者同时也验证了其他的透明化方法也得到了类似的效果（图1E）。此外，作者还比较了不同的点击化学配体（TBTA，BTTAA，BTTP）及不同的铜离子浓度下的反应效率，发现使用BTTP，150 μM硫酸铜条件下可获得高信噪比且稳定的成像（图1B）。

2.CATCH实现了药物-靶点接触的全脑、亚细胞原位成像

为了验证CATCH应用的广泛性，作者对三种小分子药物FAAH缓聚剂PF7845-yne、BIA10-2474-yne和单胺氧化酶（MAO）缓聚剂Pargyline-yne进行CATCH成像，结果清晰展示了药物-靶点在小鼠不同脑区的分布（图2A-E）。另外，还可以展示这些分子主要靶向的细胞类型，FAAH缓聚剂主要靶向新皮质和海马中的神经元样结构;而Pargyline-yne主要结合全脑的血管样结构，少量下丘脑和脑桥内稀疏但特异标记的神经元样结构（图2F）。

图2 全脑药物结合的可视化

2.CATCH可与荧光标记复合以识别靶细胞类型

作者在给药处理后进行NeuN免疫染色，发现PF7845-yne和BIA10-2474-yne主要与新皮质、海马和杏仁核中的NeuN+神经元共定位。而在脑桥中发现了一小群神经元样结构，它们是NeuN阴性但被 pargyline-yne 靶向的（图3A-D）。随后作者洗脱NeuN并重新孵育TH抗体验证该推测，确定了NeuN-，Pargyline-yne阳性的细胞的确是LC-NA神经元（图3E）。由此证明，CATCH可以和荧光标记结合揭示了药物结合的细胞类型，并且可以区分神经元不同部分的药物靶标参与位点，可以支持多轮的药物靶向细胞类型鉴定。

图3 药物靶点的细胞型鉴定

锘海团队自主研发的组织透明化试剂盒可以高效地进行脱色脱脂，采用亲水性温和环境的设计，在组织荧光保护、样本形态维持、降低自发荧光等方面表现出比较优异的性能，适用范围广、操作简便、速度快、效率高。