热点应用丨药材中黄曲霉毒素B族和G族柱后衍生HPLC检测方案

前言

黄曲霉毒素（Afatoxin，AF）作为黄曲霉和寄生曲霉的一类次级代谢产物，最 早发现于20世纪60年代。现阶段已知其衍生产物约20余种（B1、B2、G1、G2、M1、M2等），广泛存在于药材中。

值得关注的是，黄曲霉毒素一直被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质（其中B1毒性最 强），所以国际上对于霉菌毒素含量都有非常严格的限量要求。

目前，对于药材中B族和G族黄曲霉毒素的检测方法，主要参考如下标准：

《中国药典》2020版，2351通则（具体项目见表1）

对于常规反相液相色谱，由于所用的溶剂（水、甲醇、乙腈）会使黄曲霉毒素B1和G1发生荧光猝灭现象，很难直接测定。所以为了克服这一现象，通常选用柱前或柱后衍生的方式，来增加B1和G1的荧光响应值，以满足检测标准的需求。

目前常见的衍生方法有：TFA（三氟乙酸）柱前衍生法、柱后溴/碘试剂衍生法、柱后光化学衍生法以及柱后电化学衍生法。其中柱前衍生前处理过程较复杂、自动化程度低，所以现在主流方式为柱后衍生法，操作简单，灵敏度高。

本应用介绍了三种柱后衍生方案，使用赛里安LC6000高效液相色谱仪，配备高灵敏度的荧光检测器（FL 6440）。三种方案均能满足检测标准的需求，而从使用便捷性和灵敏度方面考虑，柱后光化学衍生法更为简便。

▼ 表1  2020版《中国药典》检测黄曲霉毒素的药材品种

柱后碘衍生方案

参照2020年新版《中国药典》2351通则中真菌毒素测定法，以0.05%的碘溶液为衍生试剂，使用赛里安 LC6000高效液相色谱仪四元梯度系统，搭配荧光检测器和柱后衍生单元测定四种黄曲霉毒素。

色谱条件

标准谱图示例

从谱图可以看出，使用柱后碘衍生法测定，四种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2得到了很好的分离，分离度均大于1.5，满足药典要求。

得益于赛里安 FL6440 高灵敏度的荧光检测器，四种黄曲霉毒素的最 低检出限远小于2020药典所规定的B1、G1检出限0.5μg/kg（约0.30ng/mL）以及B2、G2检出限0.2μg/kg（约 0.12ng/mL）。

▲ 柱后碘衍生法标样谱图

▲ 柱后碘衍生法检出限谱图

柱后溴衍生方案

参考柱后溴衍生的检测方法，使用50mg/L三溴化吡啶作为衍生试剂，同样采用赛里安LC6000高效液相色谱仪四元梯度系统，搭配荧光检测器和柱后衍生单元测定四种黄曲霉毒素。

色谱条件

标准谱图示例

使用与碘衍生法相同浓度的标准品溶液，但是进样量有所差异。结果可见，B1、B2、G1、G2四种黄曲霉毒素同样实现了基线分离。

从检出限上看，B1和G1检出限为0.03μg/kg（约0.075ng/mL），B2和G2检出限为0.01μg/kg（约0.025ng/mL），实验结果完全满足。

▲ 柱后溴衍生法标样谱图

▲ 柱后碘衍生法检出限谱图

柱后光化学衍生方案

与柱后溴/碘试剂衍生相比，柱后光化学衍生具备更好的易用性。配置上光衍生单元连接于色谱柱和荧光检测器中间即可直接使用，同时无需配制任何化学试剂。操作简便的同时，灵敏度也能得到有效保证，特别适用于大量样品的常规分析测定。

色谱条件

标准谱图示例

配制标准系列工作溶液：黄曲霉毒素B1和G1浓度0.1~50ng/mL、B2和G2浓度0.03~15ng/mL。按上述测试条件测试并建立标准曲线（如图所示），黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准工作曲线线性相关性r2均为 0.9999。

可见，采用柱后光化学衍生结合荧光检测器进行测定，可以满足法规对于黄曲霉毒素的检测需要，并且相比其他方法更易与操作。

▲ 黄曲霉毒素B1和G1的标准曲线

▲ 黄曲霉毒素B2和G2的标准曲线

▲ 柱后光化学衍生法标样谱图

▲ 柱后光化学衍生法检出限谱图

结论

本应用介绍了三种柱后衍生方案，均使用赛里安LC6000高效液相色谱仪（配备高灵敏度的荧光检测器）。实验结果可靠，且能够满足各项标准对于黄曲霉毒素检测的灵敏度要求，尤其是对药材在生产储存过程中的品质把控提供了解决方案。

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