综述：光透明光片介观成像技术应用与进展

前言

     17世纪荷兰科学家列文虎克发明的光学显微镜将人类带入神秘复杂、丰富多彩的微观世界，自此人们观察到了许多微小生物和构成生物的基本单元—细胞，这使得我们开始认识生物体的微观结构。光学显微成像技术作为生物医学研究不可或缺的重要工具，直接推动了细胞学、组织学、胚胎学、微生物学和古生物学等领域的快速发展，人类以此探知生命的演化、洞悉疾病的原理、解码基因的秘密。

     经典的宽场荧光显微成像技术(WFFM)具有结构简单、成像速度快的特点,但因采用落射式照明无法有效区分在焦信号和离焦背景，不具备三维光学层析成像能力。激光扫描共聚焦显微成像技术(LSCM)利用高度聚焦的激光三维逐点扫描样品激发荧光，利用针孔过滤离焦背景信号仅让在焦荧光信号被探测器收集，从而实现三维光学层析成像；但逐点扫描成像模式使得系统时间分辨率受到了很大的限制，同时因强聚焦产生的较强光毒性(光对细胞的损伤)和光漂白性(荧光染料因过度激发而失效)，使其不适合长时间观测生物样品，尤其是活体生物活体样品。

两种显微成像方式对比.(a)光片荧光显微从侧面用薄光片照明,只激发探测物镜焦平面处的样品发射荧光,在正交方向收集荧光信号成像;(b)落射式荧光显微用同一物镜激发和收集荧光,光路经过的在焦和离焦样品都会被激发。

1-光片显微成像技术

     光片显微成像的概念产生于1903年，但此后近百年间光片显微成像技术并无太多发展。1990年代，华盛顿大学的Francis实验室为了对小鼠毛细胞的结构和耳蜗的其他特性进行定量测量，发明了正交平面荧光光学切片装置，并获得了整个耳蜗的清晰荧光图像。2004年德国马普研究所的Huisken在《Science》杂志发表“Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective PlaneI llumination Microscopy”文章，该文章的发表大大促进了光片显微镜的发展和使用，文章强调了其用于胚胎发育研究的实用性，并给出了青鳉神经节细胞搏动以及果蝇胚胎发育长时间成像的荧光图像。Huisken的这篇论文和对光片显微成像技术的开发被认为是光片显微成像技术的“开山之作”，意义重大；Huisken本人也被认为是光片显微成像技术的创始人之一。

     2010年，在光片荧光显微镜研讨会上，来自光片显微成像技术研究者们决定将LSFM（light-sheet fluorescence microscopy）作为这一类显微镜的统一名称。

2-光片显微成像原理

     光片显微成像技术也被称作选择平面照明显微成像技术(SPIM)，是一种新型的三维显微成像技术。它采用正交光路设计,用一层薄光片从侧面激发样品,并在垂直于光片的方向上利用显微物镜和数字相机拍摄样品的二维荧光图像,通过轴向扫描光片或移动样品逐面成像,利用数字相机同步拍摄样品一系列不同轴向位置处的二维荧光图像,然后利用图形处理软件进行三维可视化重构。

光片显微成像的原理

     光片显微成像技术具有三维成像速度快、对比度高、低光毒性、低光漂白等诸多优点,尤其适宜于对实验动物的完整器官甚至全身以及活体生物样品进行长时间三维成像。光片荧光显微镜采用薄片层状光源取代了以往荧光显微镜的圆柱状光源，利用柱面镜聚焦或快速扫描高斯光束、贝塞尔光束等方式在探测物镜的焦面产生非常薄的片状光场，在样品内形成一块二维的光平面(sheet)，平面内的荧光分子受到光激发产生荧光，形成荧光平面，如同利用光束在立体标本中切出切片一样，“光片(lightsheet)”之名由此而来。光片的生成是光片荧光显微成像技术的核心,目前主要4种光片的生成方式，这4种光片产生方法、原理和特点对比如下：

    2004年,Huisken等提出的选择平面照明显微(SPIM)是光片荧光显微技术,具有里程碑意义,它使用柱面镜聚焦生成光片。但该方法存在以下局限:激光束经过狭缝后再由柱面镜聚焦生成光片,降低了激光能量利用率；柱面镜聚焦方法仅能生成高斯型光片场,限制了其他类型光片场的生成。2008年,Keller等进一步发展了光束扫描光片显微技术,它用扫描振镜快速扫描激光束,并经过显微物镜聚焦后可生成一个动态虚拟的光片。光束扫描生成光片方法具有以下优点:

１、扫描生成的光片场强度分布更均匀;

２、激光的能量利用率显著提升,高达95％;

３、光束扫描结合激光时空参量调控生成不同类型光片，大幅提升成像性能。

比较两种常用的光片生成方法的光片荧光显微原理图.(a)使用柱面镜聚焦方法生成光片;(b)利用振镜快速扫描光束生成光片,下部分为不同类型入射光束的横截面强度分布图。

    基于以上优势，有多种光束扫描生成光片法被应用在诸多光片显微成像系统中。关于这些光片显微成像系统本次就不详述，在之后我们再进行列举。

3-光片显微成像的优势

低光毒性、光漂白性与低光损伤：

    光毒性(phototoxicity)是指在较长时间的强光照射下，生物样本细胞内的荧光分子会产生分解现象，这是利用激光作为光源进行显微观测时无法避免的。光漂白(photobleaching) 指的是荧光分子在光照下荧光褪色减弱的过程，几乎所有的荧光团在光照下都会出现褪色。光损伤(photodamage)是指长时间或是高剂量进行激光扫描样品，令样品细胞内荧光分子受到破坏的现象。光毒性、光漂白和光损伤是荧光显微镜、共聚焦显微镜观察样本常面临的负面效应。而光片显微镜侧向照明的方式使其只需照亮观测平面即可观测所要观测的成像面，使得光毒性和光漂白效应降低几个数量级，解决了共聚焦显微镜成像时无法长时间持续观测的问题。

高时空分辨率：

     不同于共聚焦显微镜采用光电倍增管（PMT）探测，光片显微镜采用了宽视场的图像采集器：科研级互补金属氧化物半导体相机(sCMOS)进行逐面成像，使得被激发光所照射的平面所有的荧光信号都能被检测到。光片显微镜结合精确的采样定位系统便可以快速地获得样品多层次的光学切片，还可在低光毒性的基础上对活样本同时进行长时间的多色、多视角成像。

支持活体、活细胞、完整胚胎器官成像：

    光片显微镜采用的正交光路设计，使其具有较大的观测空间，可以观测较大的样本，其样品可以是较大尺度的哺乳动物的完整胚胎、器官等，也可以观察如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、斑马鱼和小鼠等模式生物的动物活体胚胎；同时高分辨的光片显微镜还可进行对于活细胞和亚细胞结构的长时间观察。

拓展性和适用性强，易于改进和优化：

    常见光源的光是容易产生衍射和散射问题的高斯光束(Gaussianbeam)存在观测视场与轴向分辨率相互制约的问题，利用艾里光束(Airy beam)或贝塞尔光束(Bessel beam)等方式来代替传统的高斯光束来产生光片，显著增强了高散射的大型生物样品的体内细胞分辨率三维成像的信号对比度和成像深度。目前针对不同的具体研究条件产生了以正交光路设计为核心的一系列光片荧光显微镜：近红外二区光片、多向选择性层状光照明显微镜(mSPIM)、特殊设计的水浸式倒置光片、数字扫描激光光片显微镜(DLSM) 、单分子倾斜平面显微镜(obSTORM)等。通过PubMed查询关键词“lightsheet”、“selective plane illumination，2021年11月已经有1725篇相关文献；截至2020年12月，被Web of Science数据库收录的以“lightsheet fluorescence”或“selective plane illumination”为关键词的文献已有超过2200篇，包括但不限于对光片荧光显微镜的改进和应用。这表示近年来光片显微成像技术得到了极大的发展和应用；这些创新和改进的光片显微成像技术，极大丰富了科研人员的生物样品成像方式，使得我们更加深入了解和感知生物体的生命活动规律。

Lightsheet=710 results(PubMed )

selective plane illumination=1,015 results(PubMed )

    此外，近年来国外内很多实验室都在进行光片显微技术开发，如利用超构表面生成光片和超分辨光片荧光显微技术：晶格光片显微技术、相干结构照明光片显微技术、受激辐射损耗光片显微技术、随机光学涨落成像光片显微技术等，这些技术正在积极探索之中,它们的突破有望改变光片荧光显微系统构架并极大拓宽在生命科学、基础医学、临床医学等方面的应用。

 比较几种超分辨光片显微技术：(a)晶格光片;(b)相干结构照明光片;(c)受激辐射损耗光片;(d)随机光学涨落成像光片

4-光透明技术

    作为与光片显微成像技术几乎同时发展起来的光透明技术，是近几年生命科学包括脑科学、血管、肿瘤病理、类脑研究的热点。光透明技术是利用化学或物理的原理与方法将大块组织或完整器官甚至活体动物透明化处理的技术，通过光学仪器直接对组织或器官内的神经、血管、细胞等结构进行观察和研究。

离体光透明系列技术：

     2007年维也纳科技大学和德国马普研究所的研究者使用BABB透明小鼠全脑并绘制出3D小鼠脑神经网络。2013年,斯坦福大学Deisseroth实验室开发出的CLARITY水凝胶光透明技术进行了小鼠全脑透明，并获取了完整无损的神经网络3D图像，包括精细回路和分子连接，这项技术轰动了，《Nature》的正面评论甚至表明：脑组织切片研究的时代可能即将终结。自CLARITY发布之后组织光透明技术迅猛发展，目前已经发展出以CUIBIC、SCALE等为代表的水性光透明技术、以CLARITY为代表的水凝胶光透明技术和以xDISCO、PEGASOS等为代表的油性的光透明技术。这三大类的光透明方法在操作流程、样品类型、透明时间、透明后样品尺度等方面都有非常大的不同。下面以图片形式简要描述三种方法的操作流程：

水性光透明方法简要操作流程

水凝胶光透明方法简要操作流程

油性光透明方法简要操作流程

活体光透明系列技术：

    对皮层神经元、胶质细胞和微脉管系统进行活体观察和操纵是大脑结构与功能研究的基础，然而皮层上方颅骨的高散射特性限制了光在组织中的穿透深度，进而影响了多种光学技术在活体皮层成像中的应用。为了克服颅骨对光学成像的障碍，研究人员不得不通过手术方式将颅骨完全/部分去除，但这些手术存在这样或那样的不足问题。离体组织光透明技术局限于离体组织器官的透明化，无法用于活体的光透明。 

    2018年武汉光电国家实验室的朱䒟教授实验室成功开发了活体光透明技术，并将该技术引入到激光血流成像和双光子成像的相关研究中。该技术不仅能够有效提高多种光学成像在活体皮层成像的对比度与成像深度，也实现了对突触分辨水平的神经结构可塑性的成像研究。该工作有望为生理/疾病状态下皮层神经与血管结构与功能性成像研究提供重要工具。

    这项活体光透明技术目前发展形成了活体颅骨光透明技术、活体皮肤光透明技术和活体硬组织光透明技术等活体光透明系列技术，并广泛应用于双光子显微成像、激光散斑血流成像、近红外二区成像、光学相干断层成像等多种成像观察的生物医学研究中。

活体颅骨光透明技术的操作流程

    光透明技术结合活体成像技术和光片显微成像技术作为一种极其重要的、无须机械切片的介观显微成像技术，极大弥补了传统机械切片显微成像技术的诸多不足，在神经科学、心脑血管研究、肿瘤病理研究、类脑研究、人工智能等各领域都具有广泛的应用场景和应用前景。

5-光透明光片介观成像技术的应用

    介观显微成像技术在近年成为研究热点，这是一种连接微观世界和宏观世界的特殊显微技术，能实现多个尺度的测量，观测范围可以细微至微米量级，亦可以庞大至厘米量级。光透明光片介观成像技术作为一项无需机械物理切片的创新性成像技术，天然的具有活体、活细胞的高分辨成像优势（分辨率可达200nm以内），同时具有完整胚胎、完整小鼠的大尺度成像优势（成像尺度可达10cm以上），因此这项技术的应用非常广泛，几乎可以用到所有已知的生物医学研究中。下面就几个方面的应用进行阐述和归纳：

发育生物学研究：

     光片介观成像技术以其低光毒性和三维实时成像为核心特性，解决了难以长时间对发育中的生命体进行显微观测的难题，已经成为发育生物学研究中的研究工具。光片显微介观成像技术经典的应用就是对3天左右斑马鱼幼体的心脏血液流动进行跟踪，根据流动数据模拟重建出心脏血液流动的三维模型，此外还可测算出每次泵动的血液流量。

    发育生物学家们甚至设计了一种智能的光片荧光显微镜，能够自适应性的跟踪胚胎发育过程，构建出小鼠胚胎从原肠胚形成到早期器官发育的全过程，在此基础上绘制出了小鼠甚至人类的的高分辨胚胎发育图谱和细胞水平的命运图谱！

光透明光片介观成像的人胚胎研究：图像依次为人体胚胎、手部感觉神经、肺部气管

神经血管相关研究：

结合整体神经标记、血管标记和免疫荧光标记技术，光透明光片介观成像技术可以进行动物和外周神经系统的发育、神经胞体定位统计、神经投射追踪以及获得亚细胞分辨率的完整动物大脑三维介观形态学图谱等研究。

光透明光片介观成像的转基因荧光鼠的神经纤维和神经细胞三维图谱

光透明光片介观成像的小鼠神经纤维投射追踪

     光透明光片介观成像技术还可以进行动物脑和肝心脾肺肾各种器官的生理性和病理性血管相关研究，可进行完整动物、器官的血管的管径、长度、密度、平滑度等统计以及细胞密度、数量等定量分析。

光透明光片介观成像的小鼠脑和肾脏等器官的血管网络三维精细结构

肿瘤和活细胞行为研究：

    光透明光片介观成像技术还可以进行动物脑和肝心脾肺肾等各类器官的生理性和病理性肿瘤相关研究；同时可用于对这些器官的肿瘤细胞定位、分布和统计，将极大促进肿瘤相关研究的进展。

光透明光片介观成像的小鼠完整器官的肿瘤细胞和血管网络三维精细结构

光透明光片介观成像技术的低光毒性、低光漂白性和低光损伤的特点，支持长时间对活细胞进行跟踪，在借助光片荧光显微镜长时间跟踪细胞行为时发现不同种类的癌细胞、中性粒细胞以及Ｔ细胞等变形细胞的行为，并以此来寻找细胞迁移过程中最易通过路径。研究人员运用该显微镜通过氧诱导视网膜病变模型观测到诸如细胞移动异常、细胞丝状伪足的改变以及之前从未观测到的病态血管簇等现象。

光透明光片介观成像的药物作用下神经元伪足快速伸展的过程

学相关研究：

    近年来，光透明光片介观成像技术在动物器官和胚胎研究中应用越来越广泛的背景下，植物学家也将其用作研究植物生理生化与发育的新工具。使用光片荧光显微镜不仅无需在叶片表面进行多余的处理，还能避免荧光成像时叶绿素所造成的误差和焦平面的光漂白现象。

6、光透明介观成像技术展望

    作为一项新型的成像技术，光透明光片介观成像技术具有的较低的光毒性、高时空分辨率、宽视场、大型样本成像，以及能与其他现有成像技术和组学分析相结合的技术优势，将极大满足科研领域日益增长的对整个生物体、组织和细胞快速、温和条件成像的需求。

     目前国际上光透明光片介观成像前沿的研究和开发有几大热点方向：

1、将光片介观成像技术同光遗传学技术结合起来，利用光片显微技术对组织的光照穿透力等特性实现光操控特定荧光标记细胞进行细胞生物学过程的研究。

2、将光片介观成像技术与当前热门基因组学、转录组学以及蛋白质组学等多组学研究相结合，为多维度认知细胞发育、行为和互作关系等提供了有力的技术支持。

3、将光片介观成像技术与深度学习技术结合，运用反卷积算法的有效解决宽场成像质量低的痛点，计算科学的加入是未来光片荧光显微镜发展的大势所趋。

4、将光片介观成像装置成本降低进而普及化，就像荧光显微镜一样，成为每一个生物医学实验室的标配。

    光透明光片介观成像技术是一种连接微观世界和宏观世界的特殊显微技术，能实现多个尺度的测量，观测范围从微米量级至厘米量级。同时，该技术作为一项无需机械物理切片的创新性成像技术，天然的具有活体活细胞的纳米级成像分辨率和跨尺度成像优势。光透明技术结合光片显微技术作为一项生物组织学成像技术，引用《NATURE》评论：将终结生物组织切片研究的时代，开启光透明介观成像新时代！
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