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表面等离子体增强NIR-II荧光用于小鼠穿颅脑成像的多

发布：上海恒光智影医疗科技有限公司

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本文要点：近红外二区(NIR-II, 1000-1700 nm) 荧光成像对于体内深层生物结构的准确可视化具有巨大潜力。然而，当前 NIR-II荧光探针的微弱荧光仍然是对不断增长的成像需求的长期挑战。本文通过将二氧化硅涂层的金纳米棒 (GNR) 和聚合物点 (Pdots) 结合到多层纳米结构中，实现表面等离子体增强 NIR-II荧光策略，在 NIR-II 成像窗口中实现了高达 6.4 的增强因子。表面等离子体增强方法已成功扩展到具有 NIR-II发射的几种类型的 Pdots 荧光团。本文最终对多层探针进行了外层封装和聚乙二醇化，并展示了表面等离子体增强的 NIR-II荧光，实现小鼠穿颅脑成像。与临床批准的ICG相比，它表现出精细的信噪比和穿透深度。

GNR@SiO2-Pdot 纳米结构的设计和制造

Schemem 1 显示了用于表面等离子增强 NIR II荧光的多层纳米探针的设计策略。作为等离子体材料，GNR 具有显著的特性：可调节的纵向等离子体峰、大的消光截面、良好的化学稳定性和高生物兼容性。大表面积和易于功能化使 GNR 成为生物分子固定化和靶向药物递送的理想载体。在这项工作中，作者利用 GNR 的表面等离子共振特性来增强 Pdots 的 NIR-II 荧光。对于体内应用，已知药代动力学和生物分布明显受粒径和表面功能化的影响。本文将 GNR 进行后续二氧化硅封装，目的是通过调整二氧化硅壳厚度来优化等离子体增强。首先通过改进的无核方法制备小型 GNR，并通过十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 进行稳定。对GNR进行了形态表征（Figure 1A），微型 GNR 可以有效地减小后续纳米探针的最终尺寸和修改过程，并避免了随着吸收截面减小而产生的强烈散射，保持了 GNRs 极好的吸收和激发增强能力。

文章选择半导体聚合物作为 NIR-II荧光发射模块，因为它们具有良好的光稳定性和大的吸收截面，有助于制备具有良好重现性和高亮度的 NIR-II纳米探针。制备得的 Pdot（m-PBTQ4F）量子产率3.2%，比非氟化对应物亮 3 倍以上。 PSMA是一种两亲性功能聚合物，在 Pdot 制备过程中引入以产生表面羧基，这使得随后的静电组装成为可能。Pdot在水中分散良好，其平均流体动力学直径约18 nm（Figure 1B）。 TEM 图像显示 Pdot 呈球形。光谱结果（Figure 1C）表明，Pdots 的荧光光谱扩展到 NIR-II 区域，荧光发射峰位于 994 和 1120 nm，肩峰位于 1300 nm 以上。此外，GNR 的吸收光谱在 805 nm 附近表现出纵向等离子体峰，同时与用于 NIR-II成像的 808 nm 激发光和 Pdot 的吸收峰很好地匹配。

已经证明，当荧光团直接与等离子体纳米粒子接触时，非辐射能量通过激发荧光团的弛豫迅速转变为表面等离子体共振；因此可能会发生荧光猝灭而不是荧光增强。为了避免荧光猝灭，在 GNR 和 Pdot 之间引入二氧化硅作为间隔层，并且设计了GNR@SiO2-Pdot 纳米粒子用于 NIR-II荧光增强。

首先，与 GNR 结合的剧毒 CTAB 被生物兼容性 PEG-SH 取代，这不仅有利于体内应用，而且有利于后续的二氧化硅涂层。配体交换过程不会改变 GNR 的良好分散性（Figure 1D）。随后，组装二氧化硅图层，其厚度可以通过改变反应时间和前体浓度来调节。然后，通过氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES) 改性过程，将GNR@SiO2 纳米颗粒与胺基团官能化。-NH2质子化为GNR@SiO2纳米颗粒提供了正电荷，带负电的 Pdots 通过静电相互作用组装到带正电的 GNR@SiO2纳米颗粒的表面上。通过TEM图像与光谱证实了 Pdots 通过静电相互作用成功组装到 GNR@SiO2纳米颗粒上。

GNR@SiO2-Pdots 的表面等离子增强 NIR-II 荧光

作者研究了GNR@SiO2-Pdot 多层探针中的表面等离子体增强 NIR-II荧光。在 808 nm 激光的激发下测量荧光发射光谱。与相同荧光团浓度（10 μg mL-1）下的游离 Pdots 相比，GNR@SiO2-Pdots的发射强度显著增强（Figrue 1H）。通过单独比较~1000 nm处的荧光峰强度，增强因子可以增加5倍，揭示了GNR@SiO2-Pdots NIR-II荧光的显著增强其效果。Figure 1E 显示，与 SiO2纳米颗粒混合后，Pdots 荧光强度略有降低；与 CTAB 封端的 GNR（无二氧化硅壳）混合时，观察到到明显的荧光猝灭。Figure 1I成像结果清楚地表明只有GNR@SiO2-Pdots 有荧光增强其效应，与光谱测量结果一致。这些观察结果证明了二氧化硅间隔层的重要性。

GNR@SiO2-Pdots 的距离依赖 NIR-II 荧光增强

作者合成了一系列二氧化硅壳厚度不同的GNR@SiO2-Pdot 多层探针。根据TEM图像，硅壳的厚度分别为3.7、8.6、11.4和15.3 nm。作为对照，还制备没有二氧化硅层的GNR- Pdots。然后将Pdots组装到纳米颗粒表面，形成具有不同厚度的硅厚度的GNR@SiO2-Pdots。

Figure 2D光谱分析表明，在没有二氧化硅层的GNR-Pdots中，荧光被猝灭；在二氧化硅厚度为3.7 nm的GNR@SiO2-Pdots中明显增强。随着二氧化硅厚度的进一步增加，NIR-II发射在8.6 nm二氧化硅厚度处达到最佳增强，在11.4和15.3 nm二氧化硅厚度处减弱。结果一致表明，表面等离子体增强的NIR-II荧光明显依赖于二氧化硅层的厚度。

为了验证等离子体系统增强 Pdot 的 NIR-II 荧光的普遍性，制备了具有不同二氧化硅厚度和不同类型 Pdots （p-PBTQ2F、p-PBTQ4F 和 m-PBTQ2F）的多层 GNR@SiO2-Pdots，然后分别进行了荧光光谱和 NIR-II 成像的表征（Figure S8 和 S9）。作者将 NIR-II 图像中 GNR@SiO2-Pdots 相对于游离 Pdots 的综合 NIR-II 荧光强度定义为增强因子。Figure 2F 显示了四种类型的 GNR@SiO2-Pdots 的增强因子随二氧化硅间隔层厚度的变化趋势。结果表明，随着二氧化硅厚度的增加，4种类型的纳米探针表现出相似的增强趋势，在8.6 nm二氧化硅厚度处，p-PBTQ2F、p-PBTQ4F、m-PBTQ2F和m-PBTQ4F Pdots的最佳增强因子分别为6.4、5.8、4.9、3.9。四种类型的Pdots的增强因子不同，可能是由于GNRs的吸收光谱与Pdots的吸收光谱有不同的重叠。四种类型的Pdots的粒径也略有不同，从而改变了Pdots到GNRs的平均距离。这些因素会影响最终的荧光增强。

用于通过颅脑成像的表面等离子增强 NIR-II 荧光

作者将GNR@SiO2- Pdots 探针应用于小鼠大脑的颅内血管成像。为了提高稳定性，GNR@SiO2-Pdots用 PVP 进一步稳定，然后用外部二氧化硅层封装，以防止 Pdots 在复杂的生物环境中从 GNR@SiO2上解离。已证明用聚（乙二醇）（PEG）密集涂覆纳米材料可增加体内循环时间。因此，通过硅烷-PEG在二氧化硅外表面的水解和缩合，GNR@SiO2-Pdots@SiO2被 PEG 功能化。最终探针的荧光光谱形状类似于GNR@SiO2-Pdots。外层二氧化硅涂层后 NIR-II荧光强度几乎保持不变，而 PEG 化可以大大改善静脉注射探针后的血液循环时间。

使用聚乙二醇化GNR@SiO2-Pdots@SiO2 探针通过头皮和颅骨对小鼠大脑的血管结构进行成像，并与ICG的成像结果进行了比较。前者血管的荧光强度要强得多，复杂的分支在视觉上比ICG更清晰，并且来自血管结构的强荧光信号在静脉注射后 2 小时保持在初始强度的约 80%。这些结果表明，本文探针凭借其高信噪比和长保留能力，在 NIR-II荧光成像中优于 ICG。最后，评估了小鼠的全身荧光成像。如Figure 3B所示，整个小鼠全身的血管结构在仰卧位和俯卧位时都以高质量清晰地成像。当鼠标处于俯卧位时，可以清楚地观察到血管，通过成像系统 SBR 等于 3.1（Figure 3C）。在仰卧位成像时，后肢血管系统的 SBR 高达 7.5（Figure 3D）。总之，这些成像结果表明，本文合成的多层探针等离子体增强 NIR-II荧光在动物研究中具有高对比度光学成像的巨大潜力。

参考文献

Peng, L.; Liu, Y.; Zhang, J.; Zhang, Z.; Liu, Z.; Fang, X.; Wang, Y.; Wu, C., Surface Plasmon-Enhanced NIR-II Fluorescence in a Multilayer Nanoprobe for Through-Skull Mouse Brain Imaging. ACS Appl Mater Interfaces 2022, 14 (34), 38575-38583.

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