“解放双手”之Online SPE-HPLC技术在药物分析中的应用

固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）技术是当前各大实验室最常用的样品前处理技术之一，相对传统的液-液萃取技术，SPE是采用固体色谱填料对目标成分进行富集，或将其复杂基质净化，减少后续分析分离的干扰。在线固相萃取-液相色谱系统（Online SPE-HPLC）将样品前处理与成分分析分离整合在一起，交由液相自动完成活化、平衡、净化、洗脱、检测等全流程，在线固相萃取色谱柱可以重复清洗使用，检测过程中可显著减少样品使用量与溶剂消耗量，减少人工操作引入误差与偏差，适合用于批量样品快速分析，分析效率极大提升，完全满足分析实验室健康绿色、降本增效的发展理念。

赛默飞双三元液相色谱系统，采用独特的双泵设计，每个泵可作为一个单独的运行体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，可同时分别控制三条流动相流路，结合柱温箱在线阀切换技术，通过灵活且成熟的流路连接设计，一套系统即可以轻松实现Online SPE以及HPLC分离过程，此外，还可以升级成为更多高级应用，如：中心切割二维液相色谱法等。软件方面，使用Chromeleon™ 色谱数据管理系统，就可以实现一站式方法建立，轻松开启Online SPE-HPLC等分析流程。

图1：双三元梯度泵外观图

图2：Online SPE-HPLC流路图（反冲模式，黄色：分析流路；蓝色：上样流路）

图3：阀切换示意图（例：反冲模式）

一、化药

使用反相固相萃取柱的Online SPE-HPLC应用案例：

以复 方甘草片中的吗 啡成分测试为例，在2020版药典中吗 啡含量测定需要进行离线固相萃取，操作流程繁琐，耗时较长，且易造成目标成分的损失，将该前处理方法转换成Online SPE方法，即可实现快速、高效的富集与净化，并直接转入分析色谱柱，取得更准确的含量测定结果。此案例从Ultimate 3000文献报道方法[1]向Vanquish HPLC实现成功转移，使用RP C18小柱（10mm）作SPE柱，方法简单，重复使用，性价比很高。

色谱条件设置：

色谱分析结果：

二、中药

反相或离子交换固相萃取柱的Online SPE-HPLC应用案例：

中药成分复杂多样，色谱分析一直存在些许挑战，尤其是复 方制剂中的活性成分含量测定，影响因素更多，其首要因素在于基质干扰更明显。利用赛默飞双三元液相色谱系统，采用在线固相萃取技术的柱切换净化方法结合电雾式检测器CAD检测，对样品进行净化（Acclaim PA2 column，3μm，4.6×50mm，PN：063189）后再自动切换到分析柱（Acclaim C18 column，5μm，4.6×150mm，PN：059148）上进行分析，取得了很好的结果。已成功应用于黄芪药材、归脾丸（浓缩丸），补肾固齿丸，益气养血口服液和颈复康颗粒等中药复 方样品的分析中[2]。

此外，选择合适填料的固相萃取柱，对生物碱的保留与峰形优化均有益处，下面的案例中采用涡流色谱MCX阳离子交换柱（Turboflow HTLC MCX-2 column，1.0×50mm，PN：CH-953456）富集以小檗碱为代表的6种异喹啉类生物碱，在线去除复杂基质干扰后，经分析柱（Acclaim C18 column，3μm，4.6×150mm，PN：059133）完成准确的含量测定，该方法普适性较好，可适用于黄连、黄柏及多种包含这两味药材的复 方制剂[3]。

Online SPE-HPLC-CAD联用测定黄芪及其复 方中黄芪甲苷的含量色谱图[2]：

Online SPE用于生物碱富集前后的色谱图表现（1号峰：黄柏碱）[3]：

三、生物药

Online SPE技术用于蛋白样本脱盐后进质谱分析的应用案例：

使用Vanquish UHPLC系统Online SPE平台对复杂的生物制药样品表征十分有帮助，且易于与高分辨质谱平台（Q Exactive HF等）进行整合，Vanquish Flex液相标配生物兼容体系，在蛋白、核酸等生物大分子分析领域应用广泛。为了保证蛋白药物的稳定性，制剂配方中往往需要加入缓冲盐溶液，但是高浓度非挥发性缓冲盐的存在，可能对质谱喷雾阶段产生影响而不能直接进样分析，需要进行样本脱盐操作，与花费大量时间、劳动的手动离线SPE相比，采用Vanquish Online SPE-2DLC用于质谱前端，方法更快，更不易出错。LC-MS系统可由Chromeleon™ CDS全面控制，满足GMP/GLP要求，是完全集成和自动化样品处理的“交钥匙”解决方案。

SPE柱温度设置对蛋白分离度的影响[4]：

质谱检测混合蛋白样品的分子量结果[4]：

四、小结

赛默飞Vanquish双三元液相色谱是创新型液相色谱系统的代表之一，凭借其智能、高效、科学的特点，全面支持分析工作者的高级方法开发与应用。其中，赛默飞Online SPE-HPLC技术已经在药物研究、环境化学、食品饮料等多个领域广泛应用，针对目标物特性，灵活选择赛默飞多种不同的化学键合相的SPE柱与分析柱，让样品前处理不再成为色谱质谱分析的“卡脖子”难题。

参考文献：

[1] 杨艳羚,李效宽,李玉桑,刘敏,奉黎静,唐和斌.在线固相萃取-HPLC测定复 方甘草片中吗 啡的含量[J].药物分析杂志,2013,33(11):1920-1923.DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.11.016.

[2] 李效宽,张艳海,冯天辉,杨艳羚,金燕.在线固相萃取法结合电雾式检测器测定黄芪及其复 方中黄芪甲苷的含量[J].分析化学,2014,42(12):1791-1796.

[3] Yuangui Yang, Lvye Liu, Zhengtao Wang, Yan Jin & Yanhai Zhang (2022):Simultaneous Determination of Protoberberine Alkaloids Derived from Coptidis Rhizoma and Phellodendri Cortex in Pharmaceuticals by On-line Solid-Phase Extraction (SPE)—HighPerformance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection (HPLC-UV), Analytical Letters, DOI:10.1080/00032719.2022.2125525

[4] TN NO .184, A pre-concentration and online solid phase extraction setup for the LC-MS analysis of therapeutic protein mixtures, http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/TN-184-SPE-LC-MS-Therapeutic-Protein-TN72161-EN.pdf