大肠杆菌检测

大肠杆菌特点

大肠杆菌是寄生在任何许多动物体内，主要是肠道内的细菌，并且可以致病，因此有必要做好大肠杆菌检测。大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）和弥散粘附性大肠杆菌(DAEC).。大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌（G-）。

1、原结构

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体O抗原、表面K抗原、鞭毛H抗原和菌毛F抗原四种。血清学分型常涉及到O抗原及H抗原。O抗原为为细胞壁脂多糖Z外层的特异性多糖；H抗原位于鞭毛上，为鞭毛蛋白抗原。

根据抗原结构不同，已知大肠杆菌有菌体O抗原170种，鞭毛H抗原60种，因而构成了许多血清型。

2、致病性

在肠道内正常栖居条件下的大肠杆菌，是不致病的。当机体免疫力低下，或当侵入肠道以外部位时，可引起肠道内或肠道外疾病，因此大肠杆菌为条件致病菌。在肠道内，某些血清型的大肠杆菌可引起急性腹泻。这些能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌。

致泻性大肠杆菌检测方法

1、血清学鉴定

血清学鉴定在大肠杆菌的检测技术发展史上占有核心地位。在毒力因子检测技术出现之前，血清学分析是致泻性大肠杆菌菌株分类的主要根据。1944年，Kauffman提出一种血清学分类的标准，该标准经过不断修改一直沿用至今。天津生物芯片公司拥有5种致泻性大肠杆菌的O抗原诊断血清系列产品。

2、生化鉴定

生化鉴定常用三糖铁琼脂（TSIA）和KIA/MIU(AA+-/++-）和IMVC（++--）来初步鉴定。Z后鉴定依据全面生化反应，典型的大肠埃希菌的基本生化反应特征：TSIA（双糖铁）产酸/产气，产气、CIT（枸橼酸盐）阴性、URE（脲酶）阴性、IDN（吲哚）阳性、MOT（动力）+/-、ORN（鸟氨酸）+/-。

3、分子生物学检测

致泻性大肠杆菌是Z早应用分子诊断法的一类致病菌。事实上，分子生物学方法是粪便菌群中致泻性大肠杆菌不同类型间相互间区分以及它们与非致病性大肠杆菌之间相区分的Z普遍、可靠的技术。目前对致泻性大肠杆菌的分子生物学检测研究，在核酸探针技术和PCR法两个方面已经获得了重大进展。

①　PCR试验：PCR是检测致泻大肠埃希菌及其毒力岛的一种重要的分子生物学诊断方法。PCR引物设计，成功地用于检测ETEC （elt、estA、estB）、EPEC （eae、bfp）、EHEC（eae、SLTI、 SLTII）、EIEC（ial、ipaH）、EAEC（aaf-II）、DAEC（daaE）等各种毒力因子和毒力岛。

②　核酸探针杂交：Moseley等首先应用DNA探针杂交代替复杂而昂贵的动物试验，检测ETEC LT和ST肠毒素。随后DNA探针技术广泛用于各类致泻性大肠杆菌的鉴定。

食品大肠杆菌菌群检测--MPN计数法

MPN（most probable number）法：即Z近似数法，也称为Z可能数法，是食品检验中常用的方法。1915年，McCrady首次发表了用MPN法 (Z大可能数法) 来估算细菌浓度的方法， 这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。

MPN法：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可应用概率理论计算菌数，实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数， 实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率Z大的一点。

举例说：稀释度为 0.01，0.001，0.0001所对应的阳性管数分别为 2-0-0 ；

查MPN检索表可知：

MPN值为92 CFU/ml(g), 当置信度为95%，则其下限和上限分别为14，380，即对应的菌落浓度区间为14~380 CFU/ml(g)，意思是：这个检验结果显示细菌浓度落在14-380 CFU/ml(g)区间均有可能，只不过92 CFU/ml(g)出现的概率Z大，概率为31.9%.

食品大肠杆菌菌群检测--平板计数法

相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢？国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠杆菌菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。

大肠杆菌平板计数法检测步骤如下：

1、制备样品稀释液，吸取1mL加入到平板中，倾注55度左右的已灭菌的VRBA琼脂15-20mL，凝固后36度24小时培养，计数紫红色菌落

2、再将合适稀释度的VRBA平板上的紫红色菌落转接10支BGLB，统计阳性率

3、再将计数的VRBA结果X阳性率X稀释度，就是Z终结果。