培养基的配制和灭菌

　　培养基，是指供给微生物、植物或动物(或组织)生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。培养基由于富含营养物质，易被污染或变质。配好后不宜久置，Z好现配现用。

一、培养基配制和灭菌原理

　　1、培养基是提供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。因为不同的微生物对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。虽然种类很多，但是培养基中一般含有必需的碳源、氮源、无机盐以及水分等，另外，培养基还应有适宜的pH。

　　2、琼脂是应用Z广泛的凝固剂，加琼脂制成的培养基在98-100℃下融化，45℃以下凝固。然而，如果琼脂多次反复融化，其凝固性就会降低。

　　3、任何一种培养基一旦制成必须及时灭菌。一般培养基灭菌采用高压蒸汽灭菌。

二、配制Z普通的细菌培养基

　　1、牛肉膏蛋白胨培养基

　　牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛和Z普通的细菌培养基(普通培养基)，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为微生物提供了碳源和能量，蛋白胨主要提供了氮源，而NaCl提供了无机盐。因为这种培养基多用于培养细菌，所以要用稀酸或稀碱将其pH调到7.2-7.4，以利于细菌的生长。

　　2、牛肉膏蛋白胨培养基配方

　　牛肉膏：3g;蛋白胨：10g;NaCl：5g;水：1000mL;pH：7.2-7.4;琼脂：15-20g。

　　3、仪器与试剂

　　牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、质量分数为10%的盐酸、质量分数为10%的氢氧化钠、烧杯、三角烧瓶、量筒、玻璃棒、玻璃漏斗、酒精灯、培养皿、牛皮纸、绳、天平、牛角匙、精密pH试纸、灭菌锅、超净工作台等。

　　4、步骤

　　(1)称量

　　根据牛肉膏蛋白胨培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中。牛肉膏放在小烧杯里称量，用热水融化后倒入大烧杯中。蛋白胨易潮湿，称量要快。

　　应注意的是，1把牛角匙用于1种药品，药瓶盖不要盖错。琼脂称好后不要急于加入到其他药品中。

　　(2)融化

　　在大烧杯中先加少于所需要的水量，把称好的各种原料成分按照配方依次加入到大杯中(牛肉膏可用50mL烧杯称量，并用少许热水溶解后再加入大烧杯中)，用玻璃棒搅匀，在石棉网上加热使其溶解，等所有加入的原料全部溶解后，补充水分到所需的体积。

　　牛肉膏蛋白胨培养基是一种固体培养基，需要加琼脂使其凝固。大烧杯用酒精灯加热至沸腾后加入琼脂，继续加热至琼脂完全融化(在加热过程中要用玻璃棒不断搅拌，以防琼脂沸腾溢出或琼脂糊底导致烧杯破裂)。

　　Z后补足所蒸发的水分。应注意的是，培养基中的各种无机盐可能相互作用产生沉淀，因此在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将2种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。

　　(3)调节pH

　　根据培养基对pH的要求，用质量分数为10%的盐酸或质量分数为10%的氢氧化钠溶液调至所需pH。测定pH可用精密pH试纸或酸度计等。

　　在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入质量分数为10%的氢氧化钠溶液，边加边搅拌，并随时用精密pH试纸测其pH，直至pH达7.2-7.4。反之，用10%盐酸溶液调节。应注意的是，pH不要调过头，以免回调影响培养基内各离子的质量分数。

　　(4)过滤

　　如果是液体培养基，就要在玻璃漏斗中放一层滤纸;如果是固体培养基或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布或2层纱布夹1层薄薄的脱脂棉趁热过滤。若无特殊要求，这一步就可以省去。

　　(5)分装

　　如下图所示，采用该分装器分装时不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。

　　应注意的是，液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜;固体分装的量一般为管高的1/5;半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜;分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

　　(6)包扎标记

　　培养基分装好后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸(笔者实验时用牛皮纸)，并用棉线包扎好。在分装好的瓶上贴上标签，写清培养基名称、组别、配制时间等。

　　(7)灭菌(下文有详细介绍)

　　(8)搁置斜面

　　将分装在试管内的培养基灭菌后冷却至50℃，将试管有棉塞端搁在玻璃棒上，搁置的试管斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

　　(9)无菌检查

　　将灭菌的培养基放在37℃恒温箱中培养24-48h，检查灭菌是否彻底。

三、培养基灭菌

　　1、定义：用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。

　　2、生物学中Z常见的灭菌方法：干热灭菌，湿热灭菌。

　　(1)干热灭菌

　　干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌2种。细胞内蛋白质的凝固性与其自身含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大时，则蛋白质凝固就越快，反之凝固缓慢。

　　与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高(160-170℃)，时间要长(1-2h)，但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧。

　　(2)湿热灭菌(Z常见的是高压蒸汽灭菌)

　　含水量越高，蛋白质凝固所需要的温度就越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固。同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

　　3、高压蒸汽灭菌是灭菌效果Z好、目前应用Z广的灭菌方法，是微生物学实验中Z常见的灭菌方法。

　　(1)高压蒸汽灭菌简介

　　高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧将锅内冷空气从排气阀中驱尽时，关闭排气阀，继续加热。由于水蒸汽无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

　　一般培养基在1.05kg/cm²、温度为121℃的情况下维持15-30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。

　　(2)高压蒸汽灭菌的操作过程和注意事项

　　①加水。打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。应注意的是，水要加够，防止在灭菌过程中干锅。

　　②装料、加盖。装料摆放平整(实践证明这一环节非常重要)。材料放好后，盖灭菌锅，采用对角线均匀拧紧锅盖上的螺丝，使蒸汽锅密封，勿漏气。

　　③排气。打开排气口(放气阀)，用电加热，待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内的冷空气完全排净。

　　④升压、保压、降压。当锅内冷空气排净后，关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升到所需压力1.05kg/cm²时(可用旋钮调节压力)，控制压力以维持恒温121℃，并开始计算灭菌时间(调节灭菌时间按钮20min即可)。灭菌结束后拔掉电源，当压力降至“0”时，打开放气阀。应注意的是，不能过早打开放气阀，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内的慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

　　⑤灭菌后的培养基空白培养。灭菌后的培养基应放于37℃恒温箱中培养，经验证24-48h无菌生长后才可保存备用。