Western Blot wb免疫印迹检测课题技术服务

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WesternBlotwb免疫印迹检测课题技术服务|实验技术服务pCzn1质粒+ArcticExpress宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。在获得重组蛋白产品的同时，我们也会提供相应的原始数据和原始图片,不需要再额外花费精力重复实验。另一方面，我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针"是抗体，“显色"用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
WesternBlot实验成功完成WesternBlot检测，必须满足4个条件：
凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
内参对照：检测标本的质量和二抗系统
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
westernblot的实验步骤及注意事项的资料
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3.用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5.室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃）
9．用总体积300mlPBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。
注意事项：
westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行westernblot。实验中取胶和膜需带手套。

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