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- 【导读】关键词:简介:世界顶尖品牌原装正品,质量保证,价格优惠。pCzn1质粒+ArcticExpress宿主菌低温表达体系。我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不...
关键词:
简介:世界品牌原装,质量保证,价格优惠。
pCzn1质粒+ArcticExpress宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。在获得重组蛋白产品的同时,我们也会提供相应的原始数据和原始图片,不需要再额外花费精力重复实验。另一方面,我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:http://www.shi极china。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心.双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化.双向电泳原理简明,diyi向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(spot).当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行。
diyi向等电聚焦
⒈从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。
⒉在小管中加入0.01gDTT,Bio-Lyte4-6、5-7各2.5ml,充分混匀。
⒊从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。
⒋从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cmpH4-7),室温中放置10分钟。
⒌沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
⒍当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
⒎分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。
⒏在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
⒐对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。
⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE电泳
⒈配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水(没有milliq的话ddh2o也行,注,水云深浪按)、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。
⒉待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。
⒊从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。
⒋配制胶条平衡缓冲液I。
5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
⒍将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒎配制胶条平衡缓冲液Ⅱ。
⒏diyi次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
⒐用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。
⒑将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
⒒将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
⒓第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
⒖用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。
⒗放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
⒚电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。
⒛进行染色。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-11-23 09:23:22
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