Western 免疫印迹具体操作说明书

Western免疫印迹具体操作说明书

上海恒远生物代做Western免疫印迹实验操作，欢迎来电咨询关于实验的有关事项，感谢您对上海恒远生物的支持与信赖，祝您实验成功。

实验试剂

1.SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2.匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。
3.转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4.0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。
5.膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。
6.显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2O21.0μl。

实验步骤

1.蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3.转移：（半干式转移）

(1)电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4.免疫反应：

(1)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

(2)加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

(3)弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

(4)加入一抗（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

(5)弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。

(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释），平稳摇动，室温2hr。
(7)弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

(8)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

注意事项

1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定Z佳条件。
2.显色液必须新鲜配置使用，Z后加入H2O2。
3.DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

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