基因表达和慢病毒构建包装纯化技术服务|实验技术服务

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pCzn1质粒+ArcticExpress宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
用DNAstar5．01和VectorNTISuite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。
（二）PCR筛选和限制酶酶切法
提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（三）核酸分子杂交法
制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（四）免疫学筛选法
获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
奇妙的克隆克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：
（1）培育优良畜种和生产实验动物；
（2）生产转基因动物；
（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；
实验流程：
1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因；
2.选择符合实验要求的载体；
3.将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体；
4.对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量（不含内毒素）的重组质粒；
5.使用GX重组载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装并收集上清液；
6.通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；
7.使用病毒液感染293T细胞，测定病毒滴度。
基因克隆过程:１、获得待克隆的DNA段（基因）；
２、目的基因与载体在体外连接；
３、重组DNA分子导入宿主细胞；
４、筛选、鉴定阳性重组子；
５、重组子的扩增与／或表达.

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