操作elisa的方法与注意事项

似乎很多做elisa实验的人都非常关注它的操作方法，其次就是它的原理啊概念啊什么的，其实还需要较为关注的就是操作的同时有哪些注意事项，关于elisa的各个方面有很多，今天，上海沪鼎生物的技术部工作人员来为大家分享一下elisa的操作方法与它的注意事项。

今天我们ZD说的是elisa的操作方法与注意事项，但是我们也先来看一看它的原理，elisa是以免疫学反应为基础，将抗原、9体的特异性反应与酶对底物的GX催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

然而由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。比较常用的是elisa双抗体夹心法及elisa接法。

说完elisa的原理，我们再来说说操作elisa的几种方法，方法一就是用于检测未知抗原的双抗体夹心法，1.包被：用0.05MPH9.碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　结果判定为：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
　　方法二就是用于检测未知抗体的间接法，用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,Z后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

以上就是elisa的操作方法，注意事项有两点。diyi点是在正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
　还有一点就是在elisa中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括了四小点，

（1）.固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的Z适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值Zda而蛋白量Z少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

其实我们在以上说了三块内容，elisa的操作方法，还有注意事项，其中还包括了原理，关于elisa的方方面面有很多，在这里我们今天呢就说这些，想了解更多资料，欢迎关注上海沪鼎生物。我司国庆期间有优惠特价打折活动，而且有买就有送，我们忠诚的期待您的来电，上海沪鼎生物恭祝朋友们生活愉快！

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2013-9-29

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