Western-blot 实验原理、实验步骤及试剂选择指南

Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的常用的方法之一。本文分别介绍western的实验原理、实验步骤以及试剂选择指南。

实验原理：

Western技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤：

1.收集蛋白样品

用适当的裂解液处理贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。某些特定组分的蛋白的蛋白抽提，请联系欣博盛为您查询。

收集完蛋白样本后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

2.电泳

2.1SDS-PAGE凝胶配置

2.2样本处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

2.3上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3.封闭

转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗掉膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，4℃封闭过夜。

4.一抗孵育

吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床上孵育1小时或者4℃孵育过夜。Western结果通常需要提供内参作为对照。通常选用Tubulin或Actin抗体，进行内参检测。

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5.二抗孵育

吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或者4℃摇床上孵育1小时。SouthernBiotech能够提供多种不同标记的二抗。

6.蛋白检测

6.1ECL化学发光，显影，定影

将A和B两种试剂在离心管中等体积混匀；1min后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中显影定影。

6.2凝胶图像分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值以及他们的比值。

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