温度梯度凝胶电泳的说明

　　在检测点突变的电泳技术中，温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)是*近出现的一种方法。*先是将这种技术应用到DNA、RNA的分子构象分析、序列变异分析以及核酸、蛋白质的相互作用研究中，并将其逐渐发展为成熟的分子生物学技术。

　　一、TGGE分析原理

　　传统的电泳分离方法基于分子的大小和带电荷数的多少，TGGE则增加了一个新的分离参数，即分子构象。稳定的构象由氢键和范德华力共同维系，并受环境温度、盐离于浓度、pH值等因素影响。如果环境温度升高到某一限定点就可以破坏氢键和范德华力，这时分子即处于变性状态，此过程就称为热变性。TGGE就是利用不同构象的分子具有不同的变性温度(Tm)来进行分离钓。在正常情况下，DNA分子呈双链结构状态;当温度升高到一定值时，DNA双链开始解开，由完整的双链变为分叉双链;如果温度继续升高，DNA双链完全解开，变为单链DNA。这种分子构象的改变会影响分子在电泳时的迁移行为，因为DNA双链的打开直接导致迁移率下降。这种影响在两条链即将完全解开时*大，此时分子的电泳速度*慢;而当全部形成单链时，泳动速度会变快。以一个杂合位点Aa来说，突变型aa与野生型AA相比只存在单碱基改变。在对杂合子个体Aa进行PCR扩增后，其PCR产物混合液中有4种组分：AA、aa、A(Waston链)a(Crick链)和a(Waston链)A(Crick链)4种不同构象的DNA双链，它们的分子质量相同但Tm值各不相同。在进行TGGE时，异源双链Aa和aA因存在不配对碱基而*先变性，同源双链AA和aa则因为碱基组成不同表现为不同的变性行为(GC碱基对有3个氢键，AT碱基对只有2个氢键)。这样，4种Tm不同的双链DNA的迁移率各不相同，*后形成4条位置不同的泳带。

　　二、TGGE实验装置和操作方法

　　TGGE分析是一种新的水平式PAGE电泳方法。根据TGGE温度梯度方向与电泳方向是否一致可以进行两种模式的TGGE：①垂直TGGE，其温度梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成。②平行TGGE，其温度梯度方向与电泳方向一致，一般采用优化后的电泳条件，可用于同时分析多个样本。

　　目前市场上已有商品化的实验装置，如德国Biometra公司的**产品TGGE sysrem。该系统包括3部分：电泳单元(温度梯度板和电泳槽)，微处理控制器(整合有电源功能)和常用附件(玻板、电极纸和胶联膜)。温度梯度板两端的温度设定值决定温度梯度的线性范围。控制器则可通过编程控制温梯板的升温时间、升温速率及电泳温度条件，并可将运行参数不间断显示出来。两个可移动的缓冲液槽可以随意放置，进行两种电泳模式的安装转换。

　　TGGE的操作过程和常见的单链构象多态性(SSCP)有些相似，但更易于控制实验条件，操作也更方便。基本操作步骤为：电泳系统安装，温度梯度编程，样本制备，PAGE凝胶灌制及上样，TGGE电泳及电泳后染色。与其他电泳方法一样，PAGE凝胶的制备、剥离及上样是TGGE分析中*具技巧性的操作，也是实验成功的关键。该系统中关于灌胶的新颖设计使这一工作变得轻松易行。首先是玻板设计，可根据需要选择不同齿突数的玻板，带齿玻板在凝胶形成的同时也形成加样孔，这样避免了插入和拔出加样梳的烦琐操作。其次是胶联膜的使用。一面疏水、另一面亲水的胶联膜可使胶液只在胶联膜与带齿突玻板间进行聚合，胶联膜的支持作用还可保证凝胶在剥取时不会破烂。使用电极纸作为电桥'>电桥连接凝胶与电泳缓冲液，简化了凝胶安装过程。

　　TGGE系统具有以下特点：①分辨率高，温度梯度由微处理器控制，线性极为严格。2mm的距离*大可对应0.6℃的温度差，即使分子间的解链温度(Tm)差异极细微也可以检测出来。②加样品量小，1～5mg的DNA或RNA上样品量即可达到清晰的电泳分离效果。③重现性好，电泳条件(如温度、时间等)易于控制，可以保证电泳的重现性和结果的重复性。④节约时间，小面积温度梯度板和小尺寸凝胶(74cmX82cm)，只需要2.5ml凝胶溶液。电泳可在30min至1h内完成。

　　三、TGGE技术的应用

　　TGGE技术的*大特点是具有高分辨能力，能够100%检出只存在单碱基差异的突变个体。该方法还具电泳条件易于控制、重现性好、操作简便快速等优点，所以这种方法出现以后很快就得到广泛的应用，包括用分子生物学技术进行研究的肿瘤学、病毒学、免疫学、群体分析和RNA研究等领域。

　　对人类疾病基因的突变，或者转基因动物突变个体的检测，或者对某些未知基因突变的筛选，都需要这种检测或筛选方法能够检出所有可能发生的突变情况。为此，Riesner等设计了一种特别的PCR—TGGE方法。与野生型相比，突变型因为碱基序列发生改变，导致TGGE电泳条带的位置改变，并且条带位置因突变位置的不同而不同。这种条带位置的改变可根据热动力学统计方程计算出来，从而确定突变发生的位置。如果要确定标本中某特异DNA或RNA序列的数量，则可采用定量PCR-TGGE方法。针对靶序列设计的内参照序列与靶基因之间只存在特定位点的单碱基改变，将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增。TGGE分离两者的扩增产物，根据两者的扩增比率就可以确定标本中靶基因的拷贝数。

　　在人类遗传病和肿瘤基因研究中，PCR—TGGE也得到广泛应用。Horn采用TGGE方法对I型神经纤维瘤(NFl)患者进行普查，发现了NFl基因的3个新突变。随着对各种遗传病和肿瘤分子病理学研究的深入，人们发现的遗传病和肿瘤相关基因日益增多，TGGE技术将会得到更多的应用。另外，TGGE方法也可用于蛋白质的分子结构和热稳定性研究，以及温度敏感蛋白质(如酶类)的分离与鉴定分析。