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- 【导读】琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳常见为题都有哪些?、一...
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳常见为题都有哪些?、
一、DNA带模糊、
1、DNA降解:琼脂糖凝胶电泳试验中要避免核酸酶污染
2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多系使用后,离子强度降解,PH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳实验,建议经常更换电泳缓冲液。
3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应该<15℃;检车所有电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
4、DNA上扬量过多:应减少凝胶中DNA上样量。
5、DNA样含盐量过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白
二、不规则DNA带迁移
1、对于λ/HindⅢ片段cos位点复性:电泳前于65℃加热DNA5分钟,然后在冰上冷却5分钟。
2、电泳条件不合适:电泳电压不超过20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液。
3、DNA变性:以20mMNaCIBuffer稀释DNA,电泳前勿加热。
三、带弱或无DNA带
1、DNA的上样量不够:增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳灵敏度稍高,上样量可适当降低。
2、DNA降解:避免DAN的核酸酶污染
3、DNA走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。
4、对于EB染色的DNA,所用光源不合适:应用短波长(254mm)的紫外光源
四、DNA带缺失
1、小DNA带走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。
2、分子大小相近的DNA带不易分辨:增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度。
3、DNA变性:电泳前请勿高温加热NDA链,以20mMNacIBuffer稀释DNA
4、DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适:在脉冲凝胶电泳上分析。
综上所述,琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点:
1.体系配制时候Z关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染:引物,酶,超纯水。这些东西Z好自己收好,写上个人的名字放好,冰盒上记得带上橡皮筋,这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了,试剂都碰掉。否则,你的试剂被污染了,到时候阴性对照狂出条带,再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净,事先可用小喷壶进行酒精喷雾,固定空气中的DNA,而且全程要戴手套,避免污染体系。
2.pcr体系要摸准,Z好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图,可以在PCR开始时候就把胶倒上(前提是你的PCR总时间在1.5小时左右,并且1.5小时候之后你还在实验室。),让凝胶凉着,这样凝胶的上样孔会比较规则,胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶,千万记得把PCR完毕的样本放4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样,不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然,排枪上样Z好选用进口吸头,国产枪头就不要想了。
5.不管电泳室使用的频率高还是低,我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液,避免出现“^”形条带。
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- 2004-08-30 09:23:16
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