免疫印迹原理、步骤及注意事项

北京索莱宝科技有限公司

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Westernblot原理
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
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Westernblot步骤
1.转膜

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的转移膜。将切好的转移膜置于水上浸2h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）。
（2）垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸
（3）小心将分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。后盖上另一个海绵垫，用夹子固定，整个操作在转移液中进行。

（4）将夹子放入转移槽中，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。
（5）转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。转完后将膜用染色液染色（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
2.免疫反应

（1）将未染色的膜用洗涤液从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2）将一抗稀释至适当浓度；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用洗涤液在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，重复步骤（2）中后一步，放入显色底物中进显色反应。
3.显色反应

（1）将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别加入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达好的效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如无暗室，可在暗盒中进行）
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Westernblot注意事项
1、切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转移液含甲醇，操作时实验室要开门以使空气流通。
2、膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
3、显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
4、硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开，请小心操作。
5、在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
6、从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
7、封闭孵育等液可在透析袋中进行。

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