实用哺乳动物细胞培养手册（下）

细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量Zda的是玻璃器皿，故工作ZZda的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留下任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）（A）强清洁液63∶1000∶200000（B）次强清洗液120∶200∶1000（C）弱清洁液100∶100∶100。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗Z好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，Z好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，Z后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

细胞培养的Zda危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射。

（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用Z广泛、效果Z好的消毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,15磅,20分钟；

布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；

玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时。

（3）化学消毒法：Z常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

细胞培养常用物品

细胞培养基

目前，市场上可提供干粉培养基和液体培养基。干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制。液体培养基是由专业产家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便。常用的培养基种类及其应用见下表：

培养基种类

应用细胞

RPMI-1640（标准型）

主要用于悬浮细胞培养

DMEM-高糖（标准型）

DMEM-低糖（标准型）

IMDM

McCoys

M199

F10

血清

平衡盐液体

PBS（Phosphate-BufferedSallines）

DPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）标准型

成分

含量（g/L）

CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)

0.10

KCl

0.20

KH2PO4

0.20

MgCl26H2O

0.10

NaCl

8.00

Na2HPO47H2O

2.16

Hanks’平衡盐溶液（Hanks’BalancedSaltSolutions，HBSS）

成分

含量（g/L）

CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)

0.14

KCl

0.40

KH2PO4

0.06

MgCl26H2O

0.10

MgSO47H2O

0.10

NaCl

8.00

NaCO3

0.35

Na2HPO4

0.048

D-Glucose

1.00

PhenolRed

0.01

D-Hanks’平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)

成分

含量（g/L）

KCl

0.40

KH2PO4

0.06

NaCl

8.00

NaCO3

0.35

Na2HPO4

0.048

D-Glucose

1.00

PhenolRed

0.01

消化液：

分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液。可以单独使用，也可以混合使用。

（1）胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的。胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在pH8.0，温度为37℃时，作用能力Z强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks』平衡盐溶液配制成0.25%溶液。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶YZ剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。

胰蛋白酶溶液配制：

（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks平衡盐溶液（pH7.2左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；

（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤CJ，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25%或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH至7.2左右。

保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20℃冰箱中，以免分解失效。

EDTA4Na溶液

EDTA是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便。常用工作液浓度为0.02%。通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1混合使用（混合液）。

注意：使用EDTA处理细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，因残留的EDTA会影响

细胞生长。

EDTA溶液配制：用无钙、镁的D-HBSS平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或4℃冰箱保存。

胰蛋白酶EDTA4Na溶液（0.05%胰蛋白酶,0.53mMEDTA4Na）

0.5g胰蛋白酶＋0.2gEDTA4Na＋1LD-HBSS。-20℃冰箱中保存。

pH调整液

（1）NaHCO3溶液

常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤CJ，分装，4℃冰箱或室温保存。当pH值超过后，可用高压灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体方法调节。

（2）HEPES（分子量238.31）溶液

HEPES使用终浓度一般为10-50mM,但通常配成1M储存液：用200ml双蒸水溶解47.6克HEPES，用1NNaOH调节pH至7.5-8.0;然后过滤CJ，分装小瓶，室温或4℃保存。抗生素溶液

酚红：

大多数培养液中使用酚红作为pH指示剂。红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH。但是，在一些特殊培养液中不含酚红，因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用。

丙酮酸钠：

是细胞液中细胞的另一种碳源。D-葡萄糖是细胞优选碳源，但是当培养液中D-葡萄糖耗尽时，细胞可以代谢丙酮酸钠获取碳源。

抗生素

哺乳动物细胞冷冻保存

主要目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的Z主要目的。

（2）减少细胞被微生物污染的危险性。

（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。

（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。

（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。

(6)降低人力和物力。

冷冻保存要点：（1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60分钟；然后转入-20℃，放置30分钟；然后再转入-80℃放置16－18小时（或过夜）；Z后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。

（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。

（3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20％。

（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，Z常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO能诱导HL-60细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。

特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要

低一些。

（2）DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO不能直接加到细胞液中，必须事先配制。

（3）DMSO必须是细胞培养级别的。新买的DMSO本身处于无菌状态，diyi次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO的尼龙滤膜。

细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。

常用细胞冷冻保存液：（1）10％DMSO＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）

（2）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：

（1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g5分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）：

冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）。

（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml冻存细胞液加入到25－30ml新鲜完全培养液中），24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。

特别注意：（1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。

（2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。

解冻冷冻保存细胞的离心方法:

(1)从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻。

（2）将1－2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。

（3）用80g离心2－3分钟，弃上清液。

（4）用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。

（5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。

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