人弥漫性大B细胞淋巴瘤小鼠肿瘤模型的建立实验

实验方法原理采用SCID小鼠皮下接种107细胞可成功地建立人人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）移植瘤模型，成瘤率70%，肿瘤的组织学表现类似于人DLBCL。实验材料

SPF级SCID小鼠

RPMI1640培养液青霉素谷氨酰胺链霉素CD19APC抗体CD20PE抗体CD24PE抗体山羊抗兔IgGFITC

流式细胞仪离心机水浴培养瓶冰箱注射器离心管封口膜微量移液器

一、细胞培养

1.SUDHL-4为人GCB样DLBCL细胞株。将初始密度为2.5×105/ml细胞置于含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、30μg/ml谷氨酰胺的RPMI1640培养液的T25细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。

2.待2-3d第1次传代后，转入T75细胞培养瓶，以后根据细胞生长情况适时移入T150细胞培养瓶。

二、流式细胞术检测样品的制备

1.取对数生长期的SUDHL-4细胞，用无血清PBS漂洗2遍后，于PBS/2%FBS中制成细胞悬液(1×107/ml)。

2.根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体，4℃避光孵育15min；若需胞内染色，则先采用1%多聚甲醛对细胞进行固定，然后用破膜剂(0.25%Saponin)处理，同时加抗体进行染色，4℃避光孵育过一夜。

3.细胞用PBS/2%FBS漂洗1遍，悬于200μlPBS待测。

4.流式细胞仪检测时每份样品均测定3×105细胞，用FlowJo软件对检测结果进行分析。

三、实验动物

1.SPF级SCID小鼠，雌性，5周龄，体重16-20g随机分组，饲养及实验均在恒温(20-26℃)、恒湿(50%-56%)的SPF级鼠房内进行。

2.小鼠置于层流架带盖鼠盒中，空气经中效过滤，喂食标准颗粒饲料，与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。

四、细胞接种

1.取对数生长期的SUDHL-4细胞，用无血清PBS漂洗2遍后，悬浮于无血清PBS。

2.实验组小鼠(每组10只)在其一侧肋部皮下接种0.1ml含107细胞的细胞悬液；2个成瘤对照组分别为每组3只，在右侧肋部皮下接种0.1ml分别含5×106细胞和1×106细胞的细胞悬液；正常对照组(每组10只)在右侧肋部皮下注射0.1mlPBS。

3.接种前小鼠不经任何处理。

五、荷瘤鼠指标检测

1.实验期间每日观察小鼠一般情况、成瘤及肿瘤生长情况。

2.每日测量体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积(计算方法：π/6×长×宽×高)；当瘤体达到1200mm3时视为人道终点。

3.小鼠经麻醉并拉颈处死后，先观察体表各部位成瘤情况；然后解剖动物，观察各内脏器官和淋巴结转移情况。

4.取下肿瘤，置于10%中性溶液固定，常规石蜡切片，HE染色观察。

六、统计学处理

实验数据以均数±标准差(X±SD)表示，采用SPSS11.5统计软件包处理，各组样本均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

一、实验讨论

虽然WHO将DLBCL列为一类独立的病种，但其在流行病学、临床特征、组织形态学、分子遗传学和免疫表型、对ZL的反应及预后等多方面，均表现出明显的异质性。DLBCL的免疫表型十分复杂，且与预后的关系非常密切。研究与肿瘤细胞发生、发展相关的蛋白表达，不仅在DLBCL的诊断分型、预后评估以及临床ZL中均具有重要的指导意义，而且有助于淋巴瘤发病机理的阐明，及特异性靶向ZL药物的研发。尽管此前曾有少量文献报道针对人类来源的DLBCL细胞株SUDHL-4的研究，本实验对SUDHL-4细胞体外培养的生物学特性和相关标记物表达进行了研究，并建立了稳定的基于SUDHL-4细胞的人DLBCL动物模型。

在不同条件下对SUDHL-4细胞进行培养后发现，10%为相对适合的血清浓度。此前有文献报道，人DLBCL细胞株体外培养建议采用Iscove'sMEM。本实验证明，采用加入10%FBS的RPMI1640培养，细胞生长良好，传代速度适中，4－5代的细胞活力旺盛，具有较高的接种成功率，且适于进行流式分析等其他实验。

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