<855> 散射光浊度法和透射光比浊法

<855> 散射光浊度法和透射光比浊法

1.     介绍

散射光浊度法和透射光比浊法是基于光散射现象原理的分析技术。光散射是一种物理现象，其中光束由于与足够小的物质粒子相互作用而改变其传播方向（称为偏转）。根据麦克斯韦电磁理论，散射发生的先决条件是悬浮颗粒的折射率必须不同于悬浮液体的折射率。差异越大，散射越强烈。光散射有两种类型：1）弹性散射，其中散射光和入射光的波长相同；2）非弹性光散射，其中散射光和入射光的波长不同。只有第一种光散射（弹性）与散射光浊度法和透射光比浊法有关。

在透射光比浊法中，测量透射光的强度，并在入射光方向（即0°）测量散射导致的入射光强度的衰减，并与入射光强度进行比较（空白测量）。被测特性是悬浮颗粒散射效应的间接测量，称为浊度。悬浮样品对光的任何吸收都会导致光强度的额外衰减（参见<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，确保被测材料不会吸收测量波长处的光非常重要。实际上，控制吸收和浊度测定的方程式是相同的（尽管衰减常数的值不同）。在散射光浊度法中，测量与入射光传播方向成90°角的散射光强度。因此，散射光浊度法浊度测量是对悬浮物散射效应的直接测量。

2. 术语和定义

描述浊度法和浊度法的常用术语包括：

•浊度（符号S）：由于悬浮颗粒的光散射效应，透射入射光束强度降低的一种度量。悬浮物的量可以通过观察透射光（比浊法）或散射光（浊度法）来测量。

log I0/It = kbc = T

I0=入射光强度

It=透射光强度

k=摩尔浊度系数

b=样品池路径长度

c=浓度

T=浊度

•浊度（符号，τ）：在透射光浊度测量中，浊度是给定悬浮液的入射光束强度/单位长度减少的量度。国际标准化组织将浊度定义为“由于存在未溶解物质而导致液体透明度降低”。

•浊度测量单位：浑浊度单位用一个描述符表示，该描述符指示测量方法。

•散射光浊度计浊度单位（NTU）：当使用散射光浊度法测量浊度时，浊度计以与入射光传播方向成90°角的角度测量散射光，浊度单位称为散射光浊度法浊度单位（NTU）。NTU的大小是根据初级福尔马肼标准品（一种将硫酸肼和六亚甲基四胺溶液混合在水中制成的悬浮液）产生的浊度定义的。更安全的聚合物微珠悬浮液现已上市，并被公认为可接受的替代品。然而，所有这些标准都可以追溯到福尔马肼。初级福尔马肼标准溶液的浊度为4000 NTU。

其他公认的浊度单位包括福尔马肼比浊法单位（FTU）和福尔马肼浊度法单位（FNU）。这些单位相当于0-40 NTU范围内的NTU。

3.     应用

透射光比浊法和散射光浊度法技术的应用包括1）溶液和/或悬浮液的浓度测定（通过在控制良好的反应参数下沉淀和悬浮产生的沉淀物，来测定几种阳离子和阴离子）；2）测量混浊溶液或悬浮液的浊度；3）测定分子量在1000到数亿之间的多分散体系的重均分子量和尺寸；4）测量免疫分析的反应动力学或免疫沉淀动力学（比率散射浊度法）；5）监测细胞和细菌的生长；6）悬浮物粒度分布测定、颗粒计数等。

比率散射浊度法广泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它还用于重组生物制药中的宿主细胞蛋白质鉴定。当使用该技术时，通过测量抗原-抗血清或抗原纯化抗体复合物的光散射反应的变化，来计算导致免疫抗体-抗原沉淀反应或凝集反应的抗原（Ag）或抗体（Ab）的量。通常考虑抗原共价连接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此产生的技术被称为“颗粒增强免疫分析”。虽然这项技术被称为散射光浊度法，但通常散射光和透射光都是用比率仪器测量的。

散射光法浊度测量在低浊度范围（散射介质浓度相对较低）更可靠。在该范围内，观察到样品浓度与检测器信号强度（以NTU表示）之间存在线性关系。随着浓度的增加，多次散射的入射角也会增加，从而偏离线性响应。支持可靠线性关系的最大NTU值在1750–2000 NTU范围内。透射光比浊法适用于更高的浊度范围（散射介质的浓度）。为了获得一致的结果，必须仔细控制所有测量变量。在可能的情况下，可以测量极稀的悬浮液。

4. 仪器仪表

用于透射光比浊法和散射光浊度法测量的仪器分别称为透射光浊度计和散射光浊度计。通常，这些仪器包括一个带有滤光器的汞灯（用于强绿线或蓝线）、一个快门、一组具有已知透射率的中性滤光器和一个灵敏的光电倍增管，该光电倍增管可安装在与入射光传播方向成0°或90°角的位置，或者在一个臂上，它可以围绕溶液单元旋转，并通过不透光外壳外的表盘设置为−135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形状多种多样，例如用于测量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射为半八角形；圆柱形可适用于所有角度的散射（见图1）。

图1.代表性浊度仪。注意，探测器2可安装在可移动臂上。

浊度也可以用标准光电滤光光度计或分光光度计测量，推荐是在光谱的蓝色部分进行照明。散射光浊度法测量需要一个装有光电管的仪器，以便接收散射光，而不是透射光。由于这与荧光计中使用的几何结构相同，因此可通过适当选择滤光片将其用作浊度计。比率浊度计结合了90°散射光浊度法和透射光比浊法。它包含光电管，接收和测量与样品成90°角的散射光，以及接收和测量样品前面的前向散射光。它还测量直接穿过样品的光。通过90°角散射光测量值，前向散射光测量值和透射光测量值之和，计算两者的比值，可获得线性度。使用比率浊度测量系统的好处是杂散光的测量变得可以忽略不计。此外，彩色悬浮液的浊度测定仅使用透射光比浊法浊度仪或浊度仪（带比率模式）进行，因为该程序补偿了悬浮液颜色导致的光衰减。通常，这些仪器中的光源是钨灯，在2700 K的灯丝温度下工作，大部分光强约为550 nm。也可使用其他合适的光源。通常，探测器是▲硅二极管▲和光电倍增管。另一种消除颜色效应的方法是使用红外发光二极管作为光源，其最大发射中心约为860 nm，光谱带宽为60 nm。当激光光源也被使用时，尤其是在浊度测量仪器中，这种技术通常被称为“激光浊度测量”。使用激光散射光浊度计的优点是，在非常低的检测水平下，信噪比显著提高。通常光源是工作波长为660 nm的激光二极管。激光束的高功率密度使较小粒子产生更高的散射强度。与吸收未散射光的光阱相结合，该系统可显著降低杂散光。当专著中的某个程序指示使用散射光浊度计或透射光浊度计时，可以使用在比率模式下工作的仪器。

5. 福尔马肼浊度标准

福尔马肼是目前已知的主要浊度标准。所有其他标准都是次要的，必须追溯到福尔马肼。 主要标准在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金书）中被定义为由用户使用明确定义的方法和条件从可追溯的材料准备的标准。

福尔马肼悬浮液有许多特点，以确保其适合作为主要标准。它可以从试剂级的起始材料中始终如一、准确地制备。该悬浮液由不同长度和随机构型的聚合物组成，其组成的聚合物的形状和尺寸从小于0.1 μm到大于10 μm不等。尽管聚合物链长分布已被证明因制备而异，但总的浊度结果是可以很好地重现的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福尔马肼标准液的制备

•硫酸肼溶液：将1.000 g ACS级硫酸肼（N2H4·H2SO4）溶解在100 mL 的A类容量瓶中中，并用无颗粒水稀释至刻度。让该溶液静置4-6小时。

•初级福尔马肼标准液：将2.50 g分析级六亚甲基四胺[(CH2)6N4]溶于25.0 mL无颗粒水中，装入100 mL烧瓶。使用A级25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，让制剂在25±1°的温度下静置48小时。由此产生的悬浮液可稳定运行2个月。

•福尔马肼储备标准悬浮液1：使用15 mL A类移液管，将15 mL福尔马肼初级标准液转移至1 L容量瓶中，并用无颗粒水稀释至刻度并混合。所得悬浮液的浊度为60 NTU。

•福尔马肼储备标准悬浮液2：使用50 mL A类移液管，将50 mL福尔马肼初级标准液转移至200 mL容量瓶中，并用无颗粒水稀释至刻度并混合。所得悬浮液的浊度为1000 NTU。

•福尔马肼参考悬浮液：根据表1，在100 mL容量瓶中混合各份福尔马肼储备标准悬浮液和无颗粒水，制备福尔马肼参考悬浮液。

6.     透射光式浊度仪与散射光式浊度仪的鉴定

特定仪器对给定程序的适用性由从选择到仪器报废的预期应用的逐步生命周期评估来确保。鉴定包括三个部分：1）安装鉴定（IQ）、2）操作鉴定（OQ）和3）性能鉴定（PQ）（参见<1058>Analytical Instrument Qualification章节）。

本节的目的是提供测试方法和验收标准，以确保仪器适合其预期用途（OQ），并在延长的时间段（PQ）内继续正常工作。与任何光谱仪一样，透射光式和散射光式浊度光谱仪必须具备波长（x轴）和光度（y轴或信号轴）的准确度及精度，并满足杂散光的要求。OQ是在实验室内吸光度和波长标度所需的操作范围内进行的。

在IQ和OQ期间，验证确定“用途适用性”的关键仪器参数的验收标准。特定仪器和应用的规格可能因使用的分析程序和最终结果的预期准确度而异。仪器供应商通常将样品和测试参数作为IQ/OQ包的一部分提供。

在以下详述的程序中，应尽可能使用主要参考标准或认证参考材料（CRM）。福尔马肼是比浊法和浊度法中目前使用的主要参考标准。所有其他标准，包括CRM，必须与福尔马肼相关。CRM应从认可的认证来源获得，并包括独立验证的可追溯值分配及相关的计算不确定性。CRM必须保持清洁，无灰尘。应定期进行重新认证，以保持认证的有效性。

6.1校准

所有透射光式浊度仪和散射光式浊度仪均根据已知浊度的标准进行校准。在首次使用之前，必须使用福尔马肼浊度标准液对仪器进行校准，至少每3个月或按照供应商的规定进行一次校准。使用至少四种福尔马肼浊度标准液进行校准，其浊度按比例覆盖感兴趣的范围。许多仪器制造商提供校准验证标准。它们通常由其中充满聚合物凝胶中的金属氧化物颗粒的密封样品池或乳胶悬浮液组成。这些标准只能用于检查仪器推荐校准的时间间隔内的校准。

6.2 Stray Light杂散光

杂散光(杂散光辐射能)是一个非常重要的误差源，特别是在较低的浊度读数范围内的测量。它被定义为到达探测器而不被样品散射的外部光线。杂散光有几种来源，包括电池表面固有缺陷、电池内部未被解释的反射、光学系统部件、光源，以及在较小程度上的电子波动。尽管仪器供应商使用了许多设计功能来最小化杂散光，但无法完全缓解杂散光。与分光光度测量不同，浊度法无法补偿杂散光。必须测量杂散光，其值应在特定仪器供应商设定的规格范围内，或在0-10 NTU范围内测量时小于0.15 NTU，在10-1100 NTU范围内测量时小于0.5 NTU，以较小者为准。

6.3测量能力的范围

仪器必须能够测量0.01–1100 NTU范围内或目标浊度50%-200%范围内的浊度。为了证明预期测量范围的线性，从表1中选择至少四种合适的参考悬浮液。

6.4解决方案

对于0-9.99 NTU的测量范围，仪器分辨率必须小于等于0.01 NTU；测量范围为10-99.9 NTU时，小于等于0.1 NTU；100 NTU以上的测量分辨率值为1 NTU。

6.5准确度

对于0-19.9 NTU的测量范围，仪器读数准确度必须为读数+0.01 NTU的±10%，对于20-1100 NTU的测量范围，仪器读数准确度必须为读数的±7.5%。

6.6性能鉴定

定期或根据需要在校准期之间完成仪器PQ。可使用仪器制造商提供的一级浊度标准（福尔马肼）或二级校准验证标准（乳胶悬浮液或密封样品池中聚合物凝胶中的金属氧化物颗粒）。

7. 步骤

7.1透射光比浊法测试步骤

样品池准备

用于样品测量的样品室必须清洁。按照样品池或仪器制造商的建议适当清洁样品池。对于低浊度测量，推荐使用一个单指数样品池或流动池，这有助于确保测量的足够精度和可重复性。使用无颗粒水，在样品池支架中找到读数最低的样品池方向。对于较高的浊度值，可使用不同的样品池。然而，样品池必须匹配（两个不同样品池在标称样品浓度下制备的标准品读数差异必须在±0.005 NTU范围内或低于测量精度要求，以较低者为准）。

样品准备

按照各专题中的规定制备样品。通过缓慢旋转或倒置容量瓶数次，仔细混合样品。避免摇晃或搅拌，因为这可能会产生气泡。对样品进行脱气有助于改进测量。对于脱气，样品可以静置几分钟，或者可以施加真空，或者可以使用超声波浴对其进行轻轻的超声波处理。脱气后，让样品静置几分钟，然后小心地反转两到三次，再次混合。将样品转移至样品池并读取读数。

流动池的使用

流动池主要用于小颗粒样品的低浊度测量。当使用这种样品池时，通过小心地将样品倒入进水仓的内边缘来引入样品。

在实际过程中，建议确保被测颗粒的沉降可以忽略不计。这通常通过在液体悬浮介质中加入保护胶体来实现。重要的是，通过将读数与在完全相同的条件下产生的已知悬浮物浓度的读数进行比较来解释结果。

7.2散射光浊度法步骤

散射光浊度法步骤的执行方式与透射光比浊法程序类似，适用于直接测量和上述比率模式下的测量。

比率模式散射光浊度法步骤

监测反应进程的总体程序包括三个明确定义的步骤：1）记录介质浊度的基线读数（空白）；2）在添加第一种试剂（抗原）后，记录浊度，这会导致浊度增加，直到达到一个稳定期；3）添加第二种试剂（抗体），这会导致另一个浊度增加和第二个稳定期，然后是最终浊度增加，直到达到第三个稳定器。根据分析目的和各自的组分浓度，从添加抗体到第三个稳定期中间选择测量区。动力学散射比浊法和终点散射比浊法是两种通用程序，用于量化免疫分析方法中形成的免疫复合物（也称为免疫散射比浊法，因为测得的浊度是由形成的免疫复合物引起的）。对于每一个步骤，都有几个参数需要在每个单独的应用中进行优化。主要参数为1）有无粒子增强；2）颗粒类型、尺寸和各自的最佳波长（如适用）；3）监测反应动力学或终点；4）考虑中的抗体/抗原，以及与之相关的抗原负载的最佳水平；5） 缓冲液和其他离子种类以及各自的最佳pH值；6）用于改变蛋白质溶解度的聚合物的类型和浓度；7）温度和其他环境因素。通常，这些参数在方法开发过程中进行了优化，具体的专著和/或章节（如适用）中给出了这些值。

动力学散射比浊法：与终点散射比浊法相比，动力学散射比浊法具有优势，主要是因为除了试剂空白读数外，还能够读取样品空白读数。该程序基于所选波长的散射光的增强强度响应来评估免疫复合物的形成速率。根据所用仪器的时间响应和应用类型，可连续监测反应动力学，或采集一定数量的数据点。有时它可能只涉及两个数据点；但是在样品和校准标准之间存在反应动力学差异的情况下，选择点可能会影响整体准确度。应仔细考虑特异性控制策略的适当选择。

终点散射比浊法：在该方法中，在添加试剂之前进行初始测量，这代表空白读数。大约60分钟后，在免疫复合物形成后进行第二次测量。这两次测量之间的差异与所分析成分的含量成正比。

8. 验证与核查

8.1 验证

当散射比浊法/透射浊度法拟用作官方物品测试程序的替代方法时，需要进行验证。当散射比浊法/透射浊度法验证的目的是证明测量适用于其预期目的，包括原料药或药品中主要成分的定量测定（I类分析）、杂质的定量测定或限度试验（II类）以及鉴定试验（IV类）。根据试验的类别（参见<1225>Validation of Compendial Procedures，表2），透射浊度法/散射比浊法的分析方法验证过程需要对准确度、精密度、特异性、检测限（DL）、定量限（QL）、线性、范围和稳健性进行试验。这些分析性能特征适用于外部标准化程序和那些使用标准添加的程序。

<1225>Validation of Compendial Procedures章节提供了分析程序验证的定义和一般指南，但没有说明每个特征的具体验证标准。以下各节的目的是向用户提供具体的验证标准，这些标准代表了对该技术的最低期望。对于每个特定应用，可能需要更严格的标准，以证明其适用于预期用途。

准确度

对于I类、II类和III类程序，可通过使用加入已知分析物浓度的适当基质进行回收研究来确定准确度。分析员还可以将使用验证中的散射光浊度法/透射光比浊法程序获得的分析结果与已建立的分析程序获得的结果进行比较。

验证标准：原料药的平均回收率为98.0%–102.0%，药品分析的平均回收率为95.0%–105.0%，杂质分析的平均回收率为80.0%–120.0%。这些标准在整个规定范围内都得到满足。

精度

重复性：通过测量六种独立制备的样品溶液在100%分析试验浓度下的浓度来评估分析程序的重复性。或者，可以通过测量三种不同浓度的单独样品溶液的三个重复的浓度来评估。三种浓度应足够接近，以便在整个浓度范围内重复性保持恒定。如果这样做，将三种浓度下的重复性汇总，以与验收标准进行比较。

验证标准：原料药的相对标准偏差为NMT 1.0%，药品分析的相对标准偏差为NMT 2.0%，杂质分析的相对标准偏差为NMT 20.0%。

中间精度：必须确定随机事件对方法分析精度的影响。典型的变量包括在不同的日期使用不同的仪器进行分析，和/或由两名或两名以上的分析员进行分析。至少，这些因素中的至少两个的组合，总共6个实验，将提供中等精度的评估。

验证标准：原料药的相对标准偏差为NMT 1.5%，药品分析的相对标准偏差为NMT 3.0%，杂质分析的相对标准偏差为NMT 25.0%。

特异性

在散射光浊度法/透射光比浊法的浊度测量中，特异性通过基质中其他成分的干扰（基质的其他成分产生真实溶液）的缺乏来证明。

检测限

可以通过计算溶液的浓度来估计检测限DL，该浓度将给出信号的信噪比≥3.3. 必须通过分析计算浓度下的样品来确认估计的DL。

定量限

定量限QL可以通过计算溶液的浓度来估算，该浓度将给出信号的信噪比≥10.0. 必须通过分析计算浓度下的样品来确认估算的QL。必须对以所需QL浓度添加的代表性样品基质制备的试液进行测量，以确认其具有足够的灵敏度和精度。在所需QL下观察到的信噪比应大于10。

验证标准:估计的定量限被认为是有效的，测量的浓度必须是准确的，并且在≤50%的规格水平上是精确的。

线性

分析物浓度和测得的浊度响应之间的线性关系必须通过制备至少四种标准溶液来证明，其浓度包括试验溶液的预期浓度。然后使用适当的统计方法（如最小二乘回归）评估标准曲线。通过降低或增加分析物浓度，可将仪器或样品因素或两者的线性偏差降低至可接受水平，从而分别将浊度读数降低或增加至透射光法浊度计/散射光浊度计仪器线性范围内。

验证标准：对于I类分析，相关系数（R）必须为NLT 0.995，对于II类定量测试，相关系数（R）必须为NLT 0.99。

范围

分析仪器（以及整个分析程序）的操作范围是样品中分析物的上下浓度（数量）（包括这些浓度）之间的间隔，已证明仪器响应函数具有适当的精度、准确度和线性水平。

验证标准：对于I类试验，100.0%中心验收标准的验证范围为80.0%–120.0%。对于非中心验收标准，验证范围为下限以下10.0%到上限以上10.0%。对于II类试验，验证范围涵盖验收标准的50.0%–120.0%。

稳健性

分析测量的可靠性通过有意改变实验参数来证明。 对于散射光浊度法/透射光比浊法，这可以包括：测量分析物在特定储存条件、变化的 pH 值和添加可能的干扰物质下的稳定性。使用适合实验程序的设计，同时确保稳健性。

8.2核查

现行的《美国生产规范条例》[21 CFR 211.194（a）（2）]表明，如果专论中提供了这些程序，则美国药典和国家处方集中描述的分析程序的用户无需验证这些程序。相反，他们只需验证其在实际使用条件下的适用性。

散射光浊度法/透射光比浊法程序验证的目的是证明测试程序在实际使用条件下的适用性。验证散射光浊度法/透射光比浊法程序适用性的性能特征与任何分析程序所需的性能特征相似。适用的一般原则的讨论见<1226>Verification of Compendial Procedure 章节。通常使用参考材料和明确定义的基质进行验证。 药典散射光浊度法/透射光比浊法程序的验证至少包括对特异性、准确度、精密度和 QL 的验证参数的执行（如 8.1 验证中所述）。

解决方案：

上海胤煌科技针对药剂的澄清度检查-仪器法推出了以下产品：

YH-CLS-1201澄清度检查分析仪

此仪器采用全彩液晶触摸屏进行操作控制，可以直接检测注射用原料药和注射剂的澄清度，并具备四级权限管理和审计追踪功能，完全满足GMP的数据完整性要求，是进行液体一致性评价的有效仪器。