热点应用丨DNA荧光信标探针检测

背景简介

分子信标探针是核苷酸序列（DNA 和 RNA 的组成部分），用于荧光检测特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信标（图 1）的设计使得序列末端的少量核苷酸碱基（5 到 7 个）彼此互补并配对形成所谓的茎。茎的形成产生了一个未配对碱基的环，称为茎环或发夹环。最 后，在核苷酸序列的一端有一个共价连接的荧光团，而在序列的另一端有一个荧光猝灭剂。当分子信标处于这种发夹形式时，猝灭剂通过 Förster 共振能量转移 (FRET) 猝灭极大地减少了荧光团的荧光。

图1：分子信标探针

与分子信标具有互补碱基的核苷酸序列称为互补 DNA (cDNA)。在cDNA 存在的情况下，分子信标发夹将打开并与 cDNA 杂交形成双链序列（图 2）。这种杂交导致猝灭剂和荧光团进一步分开，从而荧光团发射不再被猝灭。通过监测来自荧光团的荧光变化，可以识别和量化 cDNA 的存在。

图2：分子信标和cDNA之间的反应，其中a）是cDNA，b）分子信标，c）杂交双链序列。

分子信标探针可以定制设计以靶向特定的 DNA 或 RNA 序列，从而允许分子信标用于 DNA 和 RNA 的实时检测和定量。主要用于PCR 定量、体内 RNA 检测、病原体检测、病毒载量定量和研究核酸-蛋白质相互作用。分子信标的使用，加上灵敏的荧光光谱仪和样品温度控制，有助于测量极低浓度的 DNA 或 RNA。

实验设置

分子信标探针及cDNA 购自于默克公司。所有数据均从配有 SC-27 （4位温度控制样品模块） Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计获得。SC-27 用于在单独搅拌的同时加热四种具有不同浓度 cDNA 和分子信标的溶液。配置100 nM 的分子信标以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。

图3：FS5荧光光谱仪与SC-27样品架

发夹开口的温度依赖性

cDNA和分子信标之间的杂交可以在信标处于闭合发夹形式时发生，但会缓慢进行。可以通过加热分子信标以打开发夹结构来加速杂交。当加热时，发夹结构的茎碱基对之间的吸引力被克服，这被称为变性，并且发夹打开。可以使用温度依赖性荧光研究此开口的温度依赖性（图 4）。

图4：不同温度下的分子信标荧光强度

使用温控样品模块时，FS5 Fluoracle ®软件可以自动获取温度图。荧光温度图（图 4）是通过在每个温度下加热样品 20 分钟同时搅拌以确保样品均匀加热而获得的，20 分钟后，在移动到下一个温度之前测量发射光谱。可以看出，由于发夹开口和 FRET 猝灭的减少，荧光强度随温度增加而增加。实验数据发现 60°C 是发夹完全打开的适当温度，60°C 时的荧光强度是 20°C 时的 50 倍。基于这些结果，选择 60°C 作为 DNA 检测的孵育温度。

DNA检测

将具有不同 cDNA 浓度的分子信标的四种溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四个位置。为了促进 cDNA 和信标序列的杂交，将溶液通过在 60°C 加热并在该温度下保持 20 分钟进行温育。然后冷却回 20°C 并在该温度下再保持 20 分钟。这种加热和冷却的孵化过程增加了分子信标和 cDNA 之间的杂交率，如图 5 所示。

图5：SC-27中的cDNA和分子信标杂交孵化程序示意图。

孵育后四种溶液的荧光光谱依次进行测量，如图 6 所示。SC-27 可以自动测量具有相同测量参数的四种样品。可以看出，即使没有任何 cDNA 存在，仅分子信标溶液也显示出其特征发射，这是由于少量荧光团在溶液中游离。随着 cDNA 浓度的增加，由于信标与 cDNA 杂交并且信标上的荧光团未淬灭，因此荧光强度增加。

图6：在不同浓度的cDNA存在下，分子信标溶液的荧光光谱

已知 cDNA 浓度的样品的荧光强度可以建立荧光强度和 cDNA 之间的数学相关性。使用 Fluoracle ®的定量分析功能，图 6 中的测量值用于创建校准曲线，将 516 nm 峰的发射强度与 cDNA 浓度相关联（图 7）。

图7：cDNA浓度趋势分析

发现 cDNA 浓度和荧光强度之间存在以下线性关系：

Y = 1.076 × 105 + 6.024 × 102 X

其中 Y 是 516nm 处的荧光强度，X 是 cDNA 浓度，单位为 nM。

根据这种数学相关性，未知样品中 cDNA 的浓度可以通过其荧光强度确定。为了证明这一点，对具有 100 nM 分子信标浓度和未知 cDNA 浓度的样品进行孵育，并测量 516 nm 处的荧光，其cDNA 浓度为 27 nM（图 8）。

图8：cDNA已知浓度样品（橙色点）和未知cDNA浓度样品（红圈）的校准曲线。

结  论

Edinburgh Instruments FS5 荧光分光光度计用于使用分子信标探针以nM量级确定未知浓度的 DNA，与此同时，使用 SC-27 四位温度控制样品模块孵育 DNA 和探针溶液，并自动测量四种溶液的荧光强度，最 后使用 FS5 Fluoracle ®软件的定量分析功能分析测试结果。