水产品中地西 泮残留量测定的解决方案-SN/T 3235-2012

地 西泮，又名安定，属于苯二氮卓类镇静药物。在我国地 西泮被列为第二类精神药品管控，具有镇定、催眠、抗癫痫、戒酒、麻醉等作用，在人类和兽药临床使用广泛。近年来地 西泮在水产品中频繁检出，水产品中污染源头和使用意图尚不明确，可能由饵料、运输、养殖环境污染引入。地 西泮会影响水生生物行为学特征，有一定的生物蓄积作用，可通过食物链进入人体，威胁人体健康，长期暴露会导致嗜睡疲乏、精神混乱，甚至会产生依赖性和耐药性。

我国《GB 31650－2019 食品安全国家标准 食品中兽药最 大残留限量》中规定地 西泮允许作治 疗用，但不得在动物性食品中检出。农业部176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中明确禁止在饲料和饮用水中添加地 西泮。《水产养殖用药明白纸2022年1、2号》规定在水产养殖过程中不得使用地 西泮。

目前水产品中地 西泮残留量检测的标准方法是《 SN/T 3235-2012 出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》，采用基质外标法定量测定，安谱实验参照 SN/T 3235-2012 的前处理方法，并进行优化，建立了一种快速、简单、准确的测试方法-溶剂内标法。

标准溶液配制

01

标准品

地 西泮标准贮备溶液：1 000 mg/L于甲醇。货号：CDAA-S-770050-AD-1.2mL。

地 西泮-D5同位素内标贮备溶液：1 00 mg/L于甲醇。货号：CDAA-S-770054-AA-1.2mL。

02

中间溶液配制

地 西泮标准中间溶液1：1 mg/L于甲醇。

地 西泮标准中间溶液2：0.1 mg/L于甲醇。

地 西泮-D5同位素内标中间溶液1：1 mg/L于甲醇。

地 西泮-D5同位素内标中间溶液2：0.1 mg/L于甲醇。

03

系列标准工作溶液配制

分别精密量取地 西泮标准中间溶液和地 西泮-D5同位素内标中间溶液适量，用10%乙腈水溶液稀释制成地 西泮-D5浓度为2 ng/mL，地 西泮浓度为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的系列标准工作液，供LC-MS/MS测定。以地 西泮特征离子对峰面积与同位素内标物特征离子对峰面积比值为纵坐标、相应的浓度比为横坐标绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

试剂配制

乙酸铵缓冲溶液：称取7.7 g乙酸铵于480 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH值到5.2，以水定容至500 mL。   

1%氨水-乙腈溶液：准确吸取40 mL 25%的氨水至1000 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，混匀。

1%乙酸-乙腈溶液：准确吸取10 mL冰乙酸至1000 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，混匀。

无水硫酸钠：分析纯，500℃灼烧4 h，置于干燥器中备用。

前处理操作

01

样品（鱼）前处理

提取：称取试样2g（精确到0.01g）置于50mL具塞离心管中，准确加入40μL地 西泮-D5内标中间溶液2（0.1 mg/L）（加标样品加入一定量的标准中间溶液），加入8 mL乙酸铵缓冲液，高速涡旋混匀30s，室温静置30min。加入15 mL 1%氨水-乙腈溶液，5.0 g无水硫酸钠，涡旋混匀1min，4℃ 9500 r/min离心5min。收集上清液于另一个干净的50 mL具塞离心管中。剩余混合物中加入15 mL 1%乙酸-乙腈溶液，涡旋混匀10 min，4℃ 9500 r/min离心5min，吸取上清液，合并两次提取有机相至同一离心管，待净化。 

净化：向待净化液中加入QuEChERS吸附剂（货号SBEQ-CA8454-25，含600 mg MgSO4，100 mg PSA，40 mg C18），高速涡旋1 min，4℃ 9500 r/min离心5min，吸取所有有机相溶液至100 mL鸡心瓶中，42℃旋转蒸发至近干。加入2.0 mL 10%乙腈-水溶液，涡旋混合1min，过0.22μm水系滤膜，滤液供LC-MS/MS测定。

02

样品加标

①加标水平 0.5 μg/kg（对应上机溶液浓度 0.5 ng/mL）：称取样品后，加入10μL 标准中间溶液2（0.1 mg/L），n=6；

②加标水平 1.0 μg/kg（对应上机溶液浓度 1.0 ng/mL）：称取样品后，加入20μL 标准中间溶液2（0.1 mg/L），n=6；

③加标水平 2.0 μg/kg（对应上机溶液浓度2.0 ng/mL）：称取样品后，加入40μL 标准中间溶液2（0.1 mg/L），n=6。

仪器条件

01

液相色谱条件

色谱柱：Athena C18-WP 液相色谱柱（2.1mm*100mm，5μm，货号：LAEQ-211572）；

流动相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸甲醇

表1 液相色谱梯度洗脱条件

流速：0.25mL/min

柱温：35℃

进样量：10 µL

02

质谱条件

离子源：电喷雾离子源

扫描方式：正离子扫描

检测方式：多反应监测（MRM）

碰撞气(CAD)：8 psi;

门帘气(CUR)：35 psi;

喷雾气(GS1)：60 psi;

辅助气(GS2)：65 psi;

离子喷雾电压（IS）：5500V;

加热温度(TEM)：550℃；

地西 泮及地 西泮-D5的主要参考质谱参数见表2

表2 地 西泮及地 西泮-D5的主要参考质谱参数

实验谱图

图1 标准溶液谱图（1 ng/mL地 西泮+2 ng/mL地 西泮-D5）

图2 鱼肉基质空白谱图

图3 鱼肉基质加标谱图（加标水平1 μg/kg）

同位素内标法标准曲线

线性方程：y=1.05x-0.0104（r=0.9999）

同位素内标法定量结果

表3  鱼肉基质加标回收率数据

SN/T 3235-2012基质外标法测试

鱼肉中地 西泮结果

实验结论

随着科技的发展，现在市面上已经可以采购到地 西泮的同位素内标，采用溶剂同位素内标法鱼肉基质0.5、1、2 μg/kg加标回收率在80 ~100%，与采用基质外标法定量加标回收率75~110%可以达到异曲同工的效果，且可以节约大量的前处理时间。

实验耗材