植物油中氯丙醇酯和缩水甘油酯含量测定解决方案（缓慢酸水解方法）——ISO 18363-3

氯丙醇酯污染是近年来国际上出现的食品安全热点问题之一，氯丙醇酯是氯丙醇类化合物与脂肪酸的酯化产物，食品中检出量较高的是3-氯丙醇酯。

近年来的研究发现，在谷物、咖啡、鱼、肉制品、马铃薯、坚果和以植物油为原料的热加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯检出，尤其在精炼植物油等食品中检出3-氯丙醇酯的报道逐渐增加。缩水甘油酯是脂肪酸与缩水甘油的酯化产物，它与氯丙醇酯是一对孪生兄弟，形成机理相似。在油脂精炼过程中，缩水甘油酯通常会伴随3-氯丙醇酯一起形成，3-氯丙醇酯含量高，缩水甘油酯含量也高。3-MCPD可损害肾脏和生殖系统等，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将游离态3-MCPD列入2B类致癌物清单，将游离态缩水甘油列入2A类致癌物清单。

安谱实验和南京海关动植物与食品检测中心共同合作，参照国际标准“ISO 18363-3:2017”和国标征求意见稿“GB 5009.191-×××× 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定”第二篇第二法，并对方法进行优化，使用缓慢酸水解方法进行酯键断裂，苯基硼酸进行衍生，气相色谱-质谱进行检测，内标法进行定量，对不同植物油中的氯丙醇酯和缩水甘油酯的含量进行了检测，方法回收率高，精密度好。

目前安谱实验与南京海关动植物与食品检测中心已建立战略合作伙伴关系。近年来，双方已在科研项目、技术服务、培训合作、能力验证等多个层面展开合作。南京海关动植物与食品检测中心是隶属于南京海关的独立法人第三方事业单位，主要承担进出境食品、化妆品、动植物及其产品的法定检验、检测、检疫工作。在食品领域检测能力卓 越，获得国家CNAS认可、CMA资质认定和CNAS能力验证计划提供者等国内外权威资质。目前南京海关动植物与食品检测中心已完全具备食品中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测能力，并积累了多种基质的检测经验。

一、原理

在酸性溴化盐溶液中，3-氯丙醇酯转化为3-氯丙二醇（3-MCPD）单酯、2-氯丙醇酯转化为2-氯丙二醇（2-MCPD）单酯、缩水甘油酯转化为3-溴丙二醇（3-MBPD）单酯。随后，在酸性甲醇溶液中3-MCPD酯、2-MCPD酯和3-MBPD酯转化为游离态（非酯化形式），通过萃取去除样品中反应生成的脂肪酸甲酯。使用苯基硼酸对3-MCPD、2-MCPD及3-MBPD进行衍生，气相色谱-质谱检测，内标法定量。

二、标准品

实验用到的标准品信息见下表：

表1 标准品信息

01

标准品溶液配置

混合标准储备液（3-MCPD:54.7 µg/mL，2-MCPD:49.7 µg/mL，Gly:57.8 µg/mL）：准确称取5.81 mg 3-MCPD-PP、5.79 mg 2-MCPD-SS和4.88 mg GLy-P于20 mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

混合标准工作溶液I（3-MCPD:19.1 µg/mL，2-MCPD:17.4 µg/mL，Gly:20.2 µg/mL）：准确移取3.5mL混合标准储备溶液至10mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

混合标准工作溶液II（3-MCPD:1.91 µg/mL，2-MCPD:1.74 µg/mL，Gly:2.02 µg/mL）：准确移取350 μL混合标准储备溶液至10mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混匀。

内标混合标准工作溶液（D5-3-MCPD:5.0 µg/mL，D5-2-MCPD:5.0 µg/mL，D5-Gly:5.0 µg/mL）：用移液管分别准确移取0.5 mL D5-3-MCPD-PP标准溶液（100 μg/mL）、1.0 mL D5-2-MCPD-SS标准溶液（50 μg/mL）和0.5 mL D5-GLy-P标准溶液（100 μg/mL）到10 mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度线。

标品配制注意事项：

1.标准溶液浓度需根据标品实际称样质量、标品纯度以及目标物折算系数进行具体计算。

2.可选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

02

标准曲线配制

如下表所示，加入混合内标工作溶液和混合外标工作溶液，按照“样品前处理步骤”进行操作，上机检测得到标准曲线。

表2 标准曲线的配制

三、前处理步骤

试剂配置：

溴化钠酸性溶液（溴化钠3 mg/mL，硫酸5%，v/v）：将1 g溴化钠溶解于10 mL水中；取该溴化钠溶液180 μL，加入0.3 mL硫酸、5.5 mL水，剧烈震荡，充分混匀。建议每天新鲜配制。

碳酸氢钠溶液（0.6 %，m/v）：称取0.6 g碳酸氢钠于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。超声使其全部溶解。

硫酸-甲醇溶液（1.8 %，v/v ）：吸取1.8 mL硫酸于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。建议每天新鲜配制。

碳酸氢钠溶液（饱和）：称取9.6 g碳酸氢钠于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，超声震荡，取上清液使用。

硫酸钠溶液（20 %，m/v）：称取20 g硫酸钠于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。超声使其全部溶解。

苯基硼酸溶液：称取3 g苯基硼酸，加入12 mL丙酮/水混合溶液（19/1，v/v），剧烈震荡混匀。

试样提取：

准确称取0.1~0.2 g（精确至0.0001 g）食用油/油脂样品于螺口玻璃试管中，依次加入60 μL混合内标工作液，2 mL四氢呋喃，涡旋15 s（或直至样品完全溶解）。

卤化反应：

向试样提取液中加入30 μL溴化钠酸性溶液，盖紧盖子，涡旋震荡。50 ℃反应15 min，加入3 mL 0.6%碳酸氢钠溶液终止反应。加入2 mL正己烷，涡旋震荡15 s，静置分层后，转移上层液至另一螺口玻璃试管中，再用2 mL正己烷重复提取1次，合并正己烷相，氮吹至近干，用1 mL四氢呋喃溶解残渣。

试样净化：

加入1.8 mL硫酸-甲醇溶液，涡旋震荡 15 s。盖紧瓶盖，40℃反应16小时，加入0.5 mL碳酸氢钠饱和溶液终止反应。涡旋15 s，氮吹除去试样混合液中的有机溶剂（剩余液体约1 mL左右）。向剩余液中依次加入2 mL 20%硫酸钠溶液、2 mL正己烷，涡旋震荡15 s，静置分层后，弃去上层正己烷相，再用2 mL正己烷萃取一次，弃去上层正己烷相，下层的水相溶液待进行衍生化反应。

衍生化反应：

向净化液中加入200 μL苯基硼酸溶液，涡旋15 s后，于室温下超声5 min。取出后，加入1.0 mL正己烷，涡旋15 s，静置分层后，移取上层含有衍生物的有机相，加入0.5g无水硫酸钠，涡旋混匀10 s，提取液过0.22 μm的疏水性PTFE针式滤器注入进样小瓶中，供气相色谱-质谱测定。

前处理注意事项：

1.若样品常温下为固体，称样后可在 80℃水浴，250 r/min震荡搅拌2 min，直至所有脂肪融化溶解；

2.前处理过程中尽量避免试样塑料耗材，可使用玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手动进样针等耗材，建议进行方法空白实验监控过程本底情况；

3.建议使用疏水性PTFE针式滤器进行过滤。

四、仪器条件

气相色谱-质谱联用仪

色谱柱：毛细管气相色谱柱CD-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

进样量：1 μL

进样口温度：320℃，不分流进样，不分流时间1 min

载气：氦气，隔垫吹扫流量：5.0 mL/min，分流吹扫流量：20 mL/min

色谱柱流速：1.0 mL/min

升温程序：初始温度70 ℃保持1 min，10 ℃/min升至160 ℃，5 ℃/min升至180 ℃，以25 ℃/min升至325 ℃保持5 min。

传输线温度：320℃    离子源温度：280℃

离子化能量：70 eV     溶剂延迟时间：8 min

扫描模式：选择离子监测SIM模式，离子对信息见表3。

表3 目标物离子对信息

仪器维护注意事项：

1.该实验方法对仪器存在一定的污染情况，仪器受到严重污染后，可能导致目标物响应降低、分离度变差等情况，需注意仪器的清洗维护，包括进样针的清洗，离子源的清洗，色谱柱的老化等；

2.可采用加装2m预柱、使用反冲功能、程序升温进样口功能等操作，降低仪器的污染程度。

五、实验谱图

图1 氯丙醇酯和缩水甘油酯标准溶液谱图

（标线第5点 STD-5）

图2 大豆油样品空白和样品加标的TIC谱图

（下图为样品空白，上图为样品加标2mg/kg）

六、标准品

1、标准曲线数据

3-MCPD、2-MCPD、Gly的标准曲线和线性相关系数见下表。

表4 3-MCPD、2-MCPD、3-MBPD标准曲线

注：1、本实验3-氯丙醇酯使用D5-3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸双酯作为定量内标；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸双酯作为定量内标；缩水甘油酯使用D5-缩水甘油棕榈酸酯作为定量内标。

02

加标回收率数据

橄榄油和大豆油样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量和加标样品（加标水平为2.0mg/kg）回收率数据见下表。

表5  橄榄油和大豆油基质的加标回收率数据

（加标水平2.0mg/kg  n=3）

注：1、N.D表示未检出；2、酸水解方法中3-氯-1, 2-丙二醇酯不会转换成缩水甘油（Gly），因此不影响缩水甘油酯含量的计算。

03

棕榈油样品检测数据

分别使用快速碱水解方法（ISO 18363-4）和缓慢酸水解方法（ISO 18363-3）两种前处理方法检测棕榈油样品，样品含量检测数据见下表。

表6 不同方法检测棕榈油基质中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的含量对比

注：表中数据均进行了回收率折算。

七、实验结论

使用安谱实验标准品和相关耗材，参照国际标准“ISO 18363-3:2017 Animal and vegetable fats and oils - Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS - Part 3: Method using acid transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol”和国标征求意见稿“GB 5009.191-×××× 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定 第二篇第二法”，使用缓慢酸水解的方法对植物油样品的3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油酯进行检测，加标回收率在90%-115%之间，RSD均小于10%，该方法操作简便稳定。使用两种不同前处理方法检测棕榈油样品，缓慢酸水解方法的检测结果和快速碱水解方法的检测结果无明显差异，表明两种前处理方法均能够很好的满足植物油基质中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。

八、实验中所用到的耗材