分子杂交技术

　　分子杂交指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA分子或RNA)，在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为分子探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

分子杂交基本原理

　　一、DNA分子变性

　　DNA分子变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变(如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)。

　　1、DNA分子变性的方法：①加热;②改变DNA分子溶液的pH;③有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。

　　2、增色效应：DNA分子在260nm处有Z大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA分子双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应。利用DNA分子变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。

　　3、溶解曲线：如果升高温度使DNA分子变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

　　4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度)，由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度。因此Tm是指消光值上升到Z大消光值一半时的温度。

　　5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：

　　①外部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。

　　②内部因素：DNA分子的碱基比例、DNA分子的均一性;在相同条件下，DNA分子内G-C配对含量高，其Tm值也高。

　　二、DNA分子复性

　　变性DNA分子只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。

　　退火：通常DNA分子热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA分子即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。

　　复性后的DNA分子，理化性质都能得到恢复。倘若DNA分子热变后快速冷却，则不能复性。

　　影响复性速度的因素：

　　1、DNA分子浓度：愈高，复性速度也愈快。

　　2、DNA分子片段的大小：DNA分子片段愈大，扩散速度愈低，使DNA分子片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA分子切成小片段，再进行复性。

　　3、温度：过高不利于复性。

　　4、溶液的离子强度：通常盐浓度较高时，复性速度较快。

　　5、DNA分子顺序的复杂性;简单的分子复性很快，如polyd和polyd由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA分子顺序的复杂性。

核酸分子探针

　　放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为分子探针。分子探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。

　　分子探针根据标记物不同可粗分为放射性分子探针和非放射性分子探针两大类;根据分子探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA分子探针，RNA分子探针，cDNA分子探针，及寡核苷酸分子探针等几类。

　　1、DNA分子探针：

　　DNA分子探针是Z常用的核酸分子探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA分子或单链DNA分子探针。现已获得DNA分子探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA分子探针。这类分子探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

　　DNA分子探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之GC百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。

　　DNA分子探针(包括cDNA分子探针)的优点：

　　①这类分子探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。

　　②不易降解(相对RNA而言)，一般能有效YZDNA分子酶活性。

　　③DNA分子探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。

　　2、cDNA分子探针：

　　cDNA分子(complementaryDNA分子)分子探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA分子(其中U与A配对)。cDNA分子探针是目前应用Z为广泛的一种分子探针。

　　3、RNA分子探针：

　　RNA分子探针是一类很有前途的核酸分子探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA分子探针是细胞mRNA分子探针和病毒RNA分子探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA分子探针主要用于研究目的，而不是用于检测。

　　4、克隆分子探针：

　　前述三种分子探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的分子探针，就不用寡核苷酸分子探针。在DNA分子序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。

分子杂交的类型

　　分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。

　　液相杂交：液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交是一种研究Z早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交分子探针在溶液中除去较为困难和误差较高。

　　固相杂交：固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在溶液中。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA分子自我复性等优点，故该法Z为常用。根据支持物的不同固相杂交又可为：滤膜杂交、菌落分子原位杂交和组织分子原位杂交。

分子原位杂交技术

　　1、原理：

　　分子原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的分子原位杂交，它与菌落的分子原位杂交不同。菌落分子原位杂交需裂解细菌释出DNA分子，然后进行杂交。

　　而分子原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让分子探针进入细胞内与DNA分子或RNA杂交。因此分子原位杂交可以确定分子探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。

　　2、应用：

　　①对致密染色体DNA分子的分子原位杂交可用于显示特定的序列的位置;

　　②对分裂期间核DNA分子的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布;

　　③与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布;

　　④分子原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

　　3、分子探针选择：

　　用于分子原位杂交的分子探针可以是单链或双链DNA分子，也可以是RNA分子探针。通常分子探针的长度以100～400bp为宜，过长则杂交效率减低。

　　Z近研究结果表明，寡核苷酸分子探针(16～30bp)能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长分子探针。因此，寡核苷酸分子探针和不对称PCR标记的小DNA分子探针或体外转录标记的RNA分子探针是组织分子原位杂交的优选分子探针。

　　4、分子探针的标记：

　　分子探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。

　　放射性同位素中，3H和35SZ为常用。

　　3H标记的分子探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低。

　　35S标记分子探针活性较高，影像分辨率也较好。

　　32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。

　　5、组织与细胞的固定：

　　分子原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对分子探针进入细胞极为重要。

　　去除蛋白的方法是，用0.2mol/LHCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，分子原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高。

分子杂交实验的优化

　　1、分子探针的选择

　　根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸分子探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA分子或cDNA分子双链分子探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的分子探针如寡核苷酸分子探针和RNA分子探针。

　　①检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸分子探针;

　　②在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA分子单链分子探针(通过克隆人M13噬菌体DNA分子获得)或RNA分子探针，寡核苷酸分子探针也可;

　　③检测复杂的靶核苷酸序列和病原体应选用特异性较强的长的双链DNA分子探针;

　　④组织分子原位杂交应选用寡核苷酸分子探针和短的PCR标记分子探针(80～150bp)，因为它易透过细胞膜进入胞内或核内。

　　2、分子探针的标记方法

　　在选择分子探针类型的同时，还需要选择标记方法。分子探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性分子探针比非放射性分子探针的灵敏度高。

　　放射性分子探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的分子探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素分子探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。

　　3、分子探针的浓度

　　随分子探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随分子探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记分子探针与非放射性标记分子探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而分子原位杂交中，无论应用何种标记分子探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。分子探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。

　　4、杂交率

　　传统杂交率分析主要用于DNA分子复性研究，在这种情况下，分子探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在分子探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。

　　5、杂交Z适温度

　　杂交技术Z重要的因素之一是选择Z适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm的10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低(Tm-30℃)，虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA分子，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。

　　6、杂交的严格性

　　影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交Z佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm值。通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

　　7、杂交反应时间

　　在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成;时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。

　　8、杂交促进剂

　　杂交促进剂可用来促进250个碱基以上的分子探针的杂交率。对单链分子探针可增加3倍，而对双链分子探针、随机剪切或随机引物标记的分子探针可增加高达100倍。而短分子探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短分子探针本身的杂交率就高。