倒置荧光显微镜原理及应用简介

倒置荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或紫蓝光420nm）作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是检验的重要仪器之一。

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不 能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，倒置荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一，已有100多年历史。近年来，由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用， FISH、绿色荧光蛋白（GFP）技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广，显微照相、数字CCD成像技术的辅助驱动，赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。

倒置荧光显微镜和普通显微镜区别

倒置荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外，基于荧光的特性，还具备以下独特的功能要求:

(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。

(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片，从光源中选择合适的激发光谱，使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合，以期望获得Z大的荧光。

(3)为获得较弱的荧光图像，还要建立一套截止滤色片，它使所需观察的荧光进入系统成像，而将其余的光波，包括发射光阻挡在外，用来提高图像的衬度。

(4)放大的光学系统应适应荧光的特性，Z终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度  的荧光图像。

(5)仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸，保证电器安全。

(6)照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。

(7)光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。

倒置荧光显微镜原理及结构特点

在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。倒置荧光显微镜的基本构 造是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等）的基础上组成的。

荧光光源

倒置荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或紫蓝光420nm）作为激发光。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。常用的光源有超高压汞灯或发光二极管。

激发滤片

荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断（或压制）滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。

分类

倒置荧光显微镜就其光路来分有两种：

1）透射式倒置荧光显微镜

激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的倒置荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。

2）落射式倒置荧光显微镜

这是近代发展起来的新式倒置荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种倒置荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。缺点在用低倍率物镜时，像比较暗因此必须用大数值孔径的物镜，滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。

操作方法：

（1）打开灯源，如光源是超高压汞灯，要预热15min才能达到Z亮点。

（2）透射式倒置荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式倒置荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。

（3）用低倍镜观察，根据不同型号倒置荧光显微镜的调节装置，调整光源ZX，使其位于整个照明光斑的ZY。

（4）放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜油；如光源为高压汞灯，关闭后不能立即重新打开，需待汞灯完全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

（5）观察。例如：在倒置荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，观察到经0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。

倒置荧光显微镜的应用

倒置荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛，在植物细胞的观察研究中，通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。在实验中发现，倒置荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器，而且能观察到气孔的变化情况，为倒置荧光显微镜找到了一种新用途。20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维  等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。

在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后，用倒置荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光；凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

利用荧光标记技术显示微管，可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在。在紫外光激发下，叶绿体发出火红色荧光，气孔发绿色荧光，保卫细胞呈黄色或黄绿色，且形状大小非常清晰，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少，所以在倒置荧光显微镜下看不到表皮细胞。通过大量试验证明，单子叶，双子叶，裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。