荧光原位杂交检测技术

一、荧光原位杂交是什么

原位杂交技术是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

荧光原位杂交则是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。荧光原位杂交目的在于在细胞核中或染色体上显示DNA存在与含量。

荧光原位杂交过程首先将样本DNA变性，加入特定的荧光标记的探针与变性的样本混合进行杂交，退火得到双链DNA。探针信号能够被荧光显微镜捕获，从而定性、定量地检测目标DNA。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学、基因组进化研究、环境菌样分析等许多领域。

1969年，Gall和Pardue等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位YZ杂交法的创建，使FISH技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990年，Nederlof等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA序列，从而宣告了多色FISH技术的问世。

二、荧光原位杂交原理

在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。利用荧光染料与被研究对象（蛋白、多肽等）吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映有关研究对象性能的信息。

荧光原位杂交标记染色体的基本原理是通过标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，获得细胞内多条染色体（或染色体片段）或多种基因状态的信息。用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

三、荧光原位杂交探针

荧光原位杂交所用的探针大致可以分类三类：

1、位点特异型探针

标记了荧光信号的DNA片段代表了某一个或几个基因位点的全部序列。主要用以染色体DNA克隆序列的定位和靶DNA序列拷贝数及结构变化的检测。点特异型探针可用于定位DNA片段、确定染色体微小缺失与重复以及间期细胞染色体数目异常诊断。该探针信号较小

2、着丝粒探针

着丝粒探针高度重复序列DNA，重复数百次至数千次，其靶序列通常是在染色体的p11-q11区域及异染色质区域。该探针信号强，常用于标记染色体识别、染色体数目异常检测和建起细胞遗传学研究合格临床诊断。

3、染色体涂染探针

涂染探针是针对某一整条染色体设计探针，涂染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体重排和标记染色体的确定。能对整条染色体进行荧光标记。该探针特点是结果容易判读，然而整条染色体涂染探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。染色体涂染探针多用于染色体数目和结构异常分析和白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。