用什么设备观察材料加热时的微观结构

金相显微镜MJ31助力同济大学精工件材料观察

材料分析需要显微镜解决方案，用于成像、测量和分析各种材料的特征。近期，同济大学需要一款性价比高的金相显微镜，要求既能满足常规切片观察，也能对精工件材料表面进行观察。明美上海区域工程师推荐了金相显微镜MJ31搭配2000万像素显微镜相机MDX10，整体效果获得用户认可。

金相显微镜无论是在质量控制、故障分析方面，还是在研发方面，都对金属合金、半导体、玻璃、陶瓷以及塑料和聚合物等材料观察分析有重要作用，传统固定筒长金相显微镜只能满足落射观察，而明美金相显微镜MJ31采用无限远光学，落射和透射均可实现，同时使用也不会出现重影模糊等问题。

金相显微镜MJ31采用LED光源，色温在不同亮度下稳定一致，且发热低寿命长，优良的无限远光学系统与模块化功能设计理念，方便升级系统，可实现明场观察、偏光观察等功能。符合人机工程学要求的理想设计，长工作距离物镜，操作方便，空间广阔。

金相显微镜MJ31适用于金相材料组织及表面形态的显微观察，是金属学、矿物学、材料学研究的理想仪器。

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来源：https://www.mshot.com/article/1735.html

结合扫描电子显微镜的冷冻宽幅离子束铣削（Cryo-BIB-SEM）

本报告评估了结合使用冷冻宽幅离子束铣削和扫描电子显微镜（cryo-BIB-SEM）对低温稳定柔性聚合物的微观结构进行成像和分析的潜能。报告介绍了使用cryo-BIB-SEM对易损天然聚合物进行检查的结果，例如番茄果皮和木材，还分析了聚合物表面形态和多种微观结构特性。

聚合物的微观结构控制它们的化学反应性以及机械和传输特性。然而，由于亚微米等级的分析方法比较少，通常无法对柔性聚合物的微观结构进行定量表征，或不具备相关的可行性条件。冷冻断裂是少数可用的方法之一，但通过这种工艺制备的样本表面通常过于粗糙，导致制备好的样本上只有极小一部分区域适合定量SEM研究。

本报告中的结果显示，使用cryo-BIB-SEM可以对完好的样本横截面上的较大平面区域进行高清晰成像，更好地对柔性聚合物进行微观结构表征。在观察过程中，在通过cryo-BIB-SEM样本制备工艺加工的样本中，仅发现极少量的伪影，而且均非冷冻导致。

介 绍

聚合物微观机构会影响聚合物的机械和传输特性，进而决定了材料的耐久性以及对风化、冷热和光照的耐受性，因此聚合物微观结构的精确表征非常重要。

各类聚合物，无论是柔性、硬质、天然还是合成，都是如此。

Cryo-BIB-SEM可对表面完好的大尺寸低温稳定样本的微孔进行高清晰成像和化学分析。在上一篇报告中，使用Cryo-BIB-SEM研究了锂离子电池电极在干燥过程中的微观结构[1]。本报告中使用cryo-BIB-SEM表征了天然聚合物，包括木头和水果蔬菜的表皮。

如前文所述，需要以亚微米级清晰度精 准确定柔性聚合物的微观机构。然而，很少有方法能够在如此高分辨率下对这种柔性样本进行表征。另外，由于冷冻断裂工艺制备的柔性聚合物样本的表面过于粗糙，使用SEM或能量色散谱（EDS）进行定量分析时，仅能够准确研究很小一部分的表面区域。而且有机材料往往会发生膨胀收缩，使用SEM进行样本制备和测量时，尤其是对于高水分含量的材料，通常很难在材料的原生状态下进行分析。微型计算机断层成像（μCT）和SEM低温聚焦离子束铣削（cryo-FIB-SEM）等方法的分辨率则通常过低或获得的结果不具代表性。

本应用注意事项介绍了使用cryo-BIB-SEM在高分辨率（亚微米级）下对柔性、易损天然聚合物（木材和番茄表皮）的微观结构进行表征的过程。

Cryo-BIB-SEM材料和方法

Cryo-BIB可制备具有大平面区域的冷冻稳定横截面（可达4 mm²）。样本制备中包含快速冷却（淬火）步骤，可形成整齐的聚合物切口并大大降低造成断裂、变形等损坏的风险。使用液氮-雪泥对样本进行淬火，然后将样本快速转移至一个温度保持LN2水平的低温冷却阶段（图1a）[2]。使用金刚石锯在钛(Ti)掩模上方几十纳米处切割低温冷却样本，钛掩膜在后续的溅射镀膜过程中遮蔽样本。使用cryo-BIB氩(Ar)离子束铣削，制备平整的大横截面。

接下来，根据所需的信息类型，可以使用两种制备和成像方案，可以是EDS成分数据或使用SEM获得的精细结构的高清晰图像。在第 一个方案中（图1b），样本经溅射镀膜处理以方便EDS/SEM分析并提供各阶段纹理和成分的信息。在第二个方案中，样本未经过镀膜处理，以便于渗入多孔表面中的水升华。这样一来，之前被水隐藏的样本微观结构便可以完全显现出来。

使用徕卡显微系统的EM TIC 3X离子束铣削系统对木材和番茄皮（天然聚合物）样本进行冷冻宽幅离子束（cryo-BIB）铣削。将经BIB铣削的样本放进SEM（Supra 55，蔡司）之前，首先使用徕卡显微系统的EM ACE600镀膜机的溅射、碳蒸发和电子束蒸发配置对样本溅射镀膜一层薄薄的钨（W）。钨层可防止不导电样本被电子束辐射时充电。

图1a：cryo BIB-SEM样本制备工作流程使用EM TIC 3X系统执行cryo-BIB，使用EM ACE600系统进行溅射镀膜。

图1b：cryo-BIB-SEM研究中使用的2个方案的原理图，用于研究样本的：1）纹理和成本，和2）渗水后的精细亚微米结构。

结 果

分析柔性天然聚合物的主要目的是验证cryo-BIB-SEM方法在样本制备和分析过程中保存样本的精细和易损结构的能力。一个特别目标是确定使用cryo-BIB-SEM样本制备工艺制备的横截面的质量，即样本横截面是否存在伪影或损伤。

番茄皮

从一个新鲜番茄（图2a）上切一小块皮，然后按照图1中的工作流程进行制备，并按照方案2进行分析。番茄皮含有大量水分，微观结构非常复杂，因此是评估样本制备过程中因形成冰晶而发生断裂的可能性的理想材料。

图2b中显示了一个番茄皮的横截面，在横截面的上部可以看到一小片钛掩膜，掩膜上积聚了一些“溅射灰尘”。番茄细胞的精细结构清晰可见，细胞形状非常类似于之前光学显微镜观察文献中报告的形状[3]。cryo-BIB-SEM方法的清晰度更高，可以分析易损微观结构的精细细节（图2c）。

低温冷却和切割过程中未发现造成任何损伤，这说明cryo-BIB-SEM方法可以为柔性易损天然聚合物分析制备无损伤、缺陷的样本。

图2a：切割番茄的示例，表皮上标注了横截面（蓝色长方形）。使用cryo-BIB-SEM研究了这种样本。

2b：Cryo-BIB-SEM图像显示了大片的番茄表皮横截面样本。

图2c：2b中使用cryo-BIB-SEM获得的清晰度更高的番茄表皮横截面图像显示了微观结构的精细细节。

Cryo-BIB-SEM成像可揭示松木（樟子松）的细胞和微观形态。宽幅离子束铣削方法制备的细胞壁表面，上面没有切片机切割等制备方法造成的伪影。EDS提供了不同木材相位的成分，例如细胞膜质中的碳（C）和因细胞中含有大量的水而存在的氧气（O）[4]。

图3a：Cryo-BIB-SEM方法获得的松木图像（SE2），上面显示了管胞（树的木质部运输组织的伸长细胞）的微观形态和纹孔（细胞间流体交换的细胞壁部分）。

3b：使用cryo-BIB方法制备的松木的EDS图像（3a中的相同区域）细胞膜质中的碳（C，红色）信号和木材细胞所含水的氧气（O，蓝色）。

概述与结论

我们已经介绍了cryo-BIB-SEM是一种可以研究易损柔性天然聚合物的横截面的有效表征方法（番茄表皮和木材）。可对无损伤番茄表皮和木材细胞的微观结构的精细细节进行高清晰成像。另外，cryo-BIB-SEM样本制备过程中，未发现因制备而导致的断裂或样本损伤。

参考文献：

1.S. Jaiser, J. Kumberg, J. Klaver, J.L. Urai, W. Schabel, J. Schmatz, P. Scharfer, Microstructure formation of lithium-ion battery electrodes during drying - An ex-situ study using cryogenic broad ion beam slope-cutting and scanning electron microscopy (Cryo-BIB-SEM), J. Power Sources (2017) vol. 345, pp. 97-107, DOI: 10.1016/j. jpowsour.2017.01.117

2.J. Schmatz, J. Klaver, M. Jiang, J.L. Urai, Nanoscale Morphology of Brine/Oil/Mineral Contacts in Connected Pores of Carbonate Reservoirs: Insights on Wettability From Cryo-BIB-SEM, SPE Journal (2017) vol. 22, iss. 05, DOI: 10.2118/180049-PA.

3.R. Metzner, H.U. Schneider, U. Breuer, W.H. Schroeder, Imaging Nutrient Distributions in Plant Tissue Using, Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry and Scanning Electron Microscopy, Plant Physiology (2008) vol. 147, pp. 1774–1787, DOI: 10.1104/ pp.107.109215.

4.M. Nopens, J. Schmatz, Saturated pine wood sample, Pinus sylvestris, 2017, MaP Microstructures and Pores.

VMF100 微观可视化驱油工作站是北京东方德菲仪器有限公司与中石油勘探开发研究院提高采收率国家重点实验室共同研发生产的系统集成型可视化驱油系统。

VMF100 微观可视化驱油工作站，通过可视化的微流控技术，记录和分析驱替液在微纳尺度通道芯片中的驱油过程。VMF100 是定量描述不同化学驱油体系微观驱油机理的实验工作站，高效识别剩余油，并表征高含水期微观剩余油的渗流特征，VMF100工作站具有高集成化、高操控精度、芯片多样化、 分析可视化等特点，是微观驱油机理研究必不可少的设备之一。

微观可视化驱油工作站由原油注入系统、驱替液压力注入系统、压力监测系统、芯片密封系统、微纳孔道芯片，微观视频系统、操作分析软件组成。该工作站可以记录和控制饱和油及驱替的动态过程，评价剩余油再启动能力，并分析剩余油的渗流特征。

微观可视化驱油工作站的功能：
1、基础功能---剩余油分析：

---视频记录饱和油的动态过程

---视频记录驱油的动态过程

---实时记录驱油压力的动态变化

---分析不同类型剩余油的数量分布

---分析不同类型剩余油的面积分布

2、拓展功能---孔道参数：

---孔道配位数分布

---孔道孔喉比分布

---孔道等效半径分布

---孔道最窄半径分布

3、拓展功能---微观接触角：

---自动识别微观孔道接触角

---孔道微观接触角概率密度曲线

一、荧光基础知识

在显微成像中，荧光指的是一种光致发光现象，某些分子能吸收特定波长的光线，然后再发射出其他波长的光线的物理现象，这种分子一般称为荧光团。通常情况下，由于斯托克斯位移，荧光团的激发峰值和发射光谱之间存在差值，发射光线能量低于吸收光线，波长比激发光更长。

荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光也称固有荧光，是指经照射后就能发出荧光；继发荧光也称二次荧光，物质经照射后不能或只能部分发生微弱荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。目前在荧光显微技术中，主要利用的是继发荧光现象。

念珠藻叶绿体的自发荧光，明美MF52-N拍摄

荧光产生包含激发和发射两个过程，在荧光显微技术中具体体现为以下几个关键部件：

（1）激发光源：主要包含以下两个指标

Ø 光源光谱覆盖发射光谱：荧光团在特定波段范围才能被大部分激发，因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光团激发特征。

Ø 发射光谱波段的强度：荧光信号一般较弱，需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。

（明美-四通道LED光源MG120，宽光谱 + 高光功）

（2）激发块：用于形成特异性激发/发射的一组滤光片，一般包含以下三个

Ø 激发滤光片EX：滤过光源中特定波段的光，用以激发样本中特定染料

Ø 发射滤光片EM：允许荧光团发射的特定波段的光通过

Ø 二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。透射荧光显微镜没有这个滤光片，但目前主流都是落射荧光显微镜，会有二向分光镜。

（明美可定制适配四家品牌，不同波段需求的激发块）

二、荧光显微成像的应用

荧光显微镜利用自发荧光或继发荧光现象，广泛用于生物（医学）、矿物、材料科学等领域的显微荧光观测。①在生物学领域，主要借助荧光染料标记，可准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。②在矿物学领域，通常用于研究有自发荧光特性的物质，如石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。③在材料科学，可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张，在半导体领域，也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED荧光显微镜观察SBS改性沥青

（MF43-N拍摄的磁珠荧光图片）

荧光显微技术在生物学领域中应用是广泛也是复杂的，主要是对细菌、细胞、组织或小型生物（如斑马鱼等模式生物）进行标记成像，它的微观层面都是通过荧光染料对分子层面进行标记。从荧光染料的选择看，通常需要考虑几个因素，一是荧光染料标记的位置，二是该染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖进行染色，甚至钙离子等非生物物质也可以检测。以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：

FITC荧光染色，MF52-N拍摄

（1）免疫荧光（IF）：主要标记的是蛋白质。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。

Ø FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，495/517 nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。

Ø TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，550/573 nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。

Ø 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光量子产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。

Ø Alexa Fluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。

DAPI荧光染色，MF52-N拍摄

（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置。

Ø DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在358nm处有一个吸收峰值，在461nm处有一个发射峰值，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。

Ø Hoechst（33258、33342、34580）：这三种染料都可在350nm左右的紫外光激发，在461nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。

Ø PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，激发波长为538 nm，发射波长为617 nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。

Fura2钙离子探针做的研究图片， 引自公开文献
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）离子成像：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。

三、荧光显微成像的挑战

应用荧光显微技术进行成像的过程中，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微技术应用中的常见挑战与应对方法：

汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用

（1）激发光源选择和使用。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，寿命较短可能就200小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，替换灯泡后需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-100，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。

明美可定制适配四家品牌的滤光片组

（2）滤光片质量和匹配度。激发块中的滤光片质量会影响激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，明美建议使用数显荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四家品牌显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光需求，明美提供匹配四家品牌主流荧光显微镜的激发盒和滤光片组，可按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。

（MF43-N+MC50-S拍摄的小鼠脑片荧光图像）

（3）光毒性与荧光染料毒性：在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用具有较低能量（波长较长）激发光谱的荧光染料；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，需要在成像质量与样本健康之间保持平衡；③降低帧速率，尤其在长时间的荧光成像中，这种情况需要提高相机的灵敏度，保证捕获微弱的荧光信号。

（单通道荧光拍摄，经软件合成多色荧光图像）

（4）多色荧光成像：在生物学领域应用较多，尤其是在对活细胞标记成像时，需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，而大多数荧光染料具有宽发射光谱，在使用多种染料标记时会出现荧光光谱重叠现象。对于多色荧光成像，有两种应对思路，一是针对每种染料使用对应的单通道窄带滤光片，后通过软件进行合成，这种方式对成像速度及软件图像处理提出较高要求；二是使用宽光谱光源同时激发，选用双通滤光片或多通滤光片，这种滤光片的的特点是允许两种或以上波段荧光信号通过，可实现一组滤光片同时观察两种或以上荧光染料，这种方式要求相邻的发射光谱范围没有重叠，所得到的荧光信号之间能较好的被区分。

（双通滤光片荧光拍摄，镜下可同时观察到B\G两种荧光信号）

来源：https://www.mshot.com/article/1527.html