荧光寿命成像显微镜包括哪些部分

胰岛α细胞和β细胞功能失调导致的糖尿病患者，无法维持正常的血糖水平。为了解其中的规律，我们使用了多光子相量-FLIM对NADH自发荧光成像来检测葡萄糖刺激前后胰岛活细胞的代谢变化。多光子相量FLIM NADH自发荧光成像为监测活体中的代谢状态提供了一种直接的检测和分析方法。与此同时，它还为在延时状态下分别监测α细胞和β细胞提供了高空间分辨率。我们观察到，对健康胰岛实施葡萄糖刺激后，β细胞中氧化磷酸化水平上升，α细胞中氧化磷酸化水平受到抑 制，这在患有II型糖尿病的胰岛中未观察到。这证明，相量FLIM可以作为监测细胞代谢和糖尿病研究中的药物发现。 

图像：小鼠胰岛的代谢成像

扫描透射电子显微镜（STEM）作为现代科研与材料分析中的重要工具，凭借其的成像精度和微观结构解析能力，广泛应用于纳米科技、材料科学、生物医学等多个领域。了解其结构组成，有助于深化对设备工作原理的理解，从而提升其使用效率及维护的科学性。本文将详细解析扫描透射电子显微镜的各个关键组成部分，包括电子源、扫描系统、透镜系统、检测系统及数据处理单元等，揭示其复杂但高效的设计架构，以便相关从业者或研究人员对设备的内部结构有一个系统的认知。

电子源是扫描透射电子显微镜的核心部分之一，其功能是产生高速电子束。常用的电子源类型包括钨丝灯、场发射枪（FEG）以及激光电子源。场发射枪尤为普遍，原因在于其能提供极高的亮度和细锐的电子束，从而确保图像的清晰度和分辨率。电子源的稳定性直接关系到显微镜的成像质量和工作效率，因此高质量的电子源在设备中占有重要位置。

扫描系统是实现像素级电子束扫描的关键。它包括扫描线圈或扫描镜，能够精确控制电子束在样品表面上的移动路径。通过快速而精密的扫描控制，显微镜可以在样品上生成二维或三维的细节图像。扫描系统的设计需兼顾快速速度与微米甚至纳米级的定位精度，确保成像过程中电子束的轨迹一致且质量稳定。

透镜系统则是显微镜中用以调节电子束照射样品的装置，主要由电子透镜组成。这些透镜由电磁线圈组成，通过改变其电流，实现对电子束进行聚焦、放大或偏转。透镜的性能直接影响成像放大倍率及分辨率。现代扫描透射电子显微镜中，电子透镜的设计趋于复杂，以满足纳米尺度的成像需求。在不同的成像模式下，透镜系统还能调节电子束的能量和焦距，提高成像的多样性和专业性。

检测系统作为采集电子束与样品相互作用信息的关键部分，通常由多种探测器组成。如荧光屏、电子计数器、能谱仪等，根据不同的成像和分析需求，提供相应的信号处理。特别是针对于STEM的高空间分辨率需求，探测器不仅要具备高灵敏度，还要能多角度、多模式地收集电子信号，从而获得更丰富的样品结构信息。

现代扫描透射电子显微镜配备了先进的数据处理单元。这一部分融合了高性能的计算平台，能够实时处理和分析从检测系统传来的信号。通过图像重建、噪声滤波、元素分析等技术，研究人员可以得到更为详尽、准确的微观结构信息。数据处理单元的优化直接关系到成像的效率和精度，也影响到科研或工业应用的结果质量。

整体而言，扫描透射电子显微镜作为一套高度集成的科学仪器，其成功依赖于各个组成部分的紧密协作。从高亮度、稳定的电子源到复杂精密的透镜系统，从多功能的检测器到强大的数据分析平台，每一环都在高效实现样品微观细节的成像中发挥着关键作用。这些硬件的不断创新与优化，正推动着电子显微技术向更高的分辨率和更广泛的应用领域迈进，为科研探索开启了新的可能。

透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）作为现代科学研究中的一项重要工具，广泛应用于材料科学、生物学、化学等领域。它的工作原理和成像技术为我们揭示了物质的微观结构，尤其是能够深入到纳米级别，观察细胞内部的精细结构以及各类材料的晶体结构。本文将详细介绍透射电子显微镜如何进行成像，探讨其成像原理、过程及其优势，为理解其在科研中的重要作用提供清晰的视角。

透射电子显微镜的成像原理

透射电子显微镜通过利用电子束与样品的相互作用进行成像。与传统光学显微镜不同，透射电子显微镜使用高能电子束而非光线，因为电子波长远小于可见光，从而能够观察到比光学显微镜更为细微的物质结构。当电子束通过样品时，部分电子被样品中的原子散射或透过，另一部分则未受影响。通过检测这些不同的电子束，电子显微镜能够绘制出样品的详细影像。

成像过程

1. 电子束的生成与聚焦 透射电子显微镜的电子束通常由一个加速器产生并通过电磁透镜聚焦成极细的电子束。加速后的电子束具有极高的能量，可以穿透很薄的样品。

2. 样品的制备 样品必须足够薄，以便电子束能够透过。一般来说，样品的厚度需要控制在100nm以下，这样电子才能顺利通过并获得清晰的成像。

3. 与样品的相互作用 当电子束与样品的原子发生相互作用时，部分电子会被散射，部分则通过样品。这些散射电子和透过电子的不同程度为成像提供了信息。

4. 成像与放大 整个透射过程通过一系列的透镜系统，将透过样品的电子聚焦到荧光屏或相机上，从而形成样品的高分辨率图像。不同的电子透过样品的路径、散射程度以及强度变化构成了图像的细节。

透射电子显微镜的优势

1. 高分辨率 透射电子显微镜的大优势在于其超高的分辨率，能够观察到原子级别的细节。由于电子的波长比可见光波长短，它能揭示光学显微镜无法捕捉到的微观结构。

2. 纳米尺度观察 TEM不仅能够看到纳米尺度的细节，还是观察材料、细胞、病毒等微观结构的首选工具，广泛应用于科学研究及临床诊断中。

3. 多功能性 除了成像，透射电子显微镜还可以进行化学成分分析（如电子能量损失谱、X射线能谱等），进一步提高了其应用的广泛性和准确性。

结语

透射电子显微镜作为现代科研不可或缺的工具，其高分辨率和独特的成像原理使其在微观结构观察中具有无可替代的地位。无论是在材料科学还是生物学领域，TEM为我们提供了观察微观世界的新视角和深度，使我们得以深入探索细胞、材料和纳米结构的复杂性。

1953年，科学家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克发现了DNA分子的双螺旋结构，遗传学的研究进入到分子层次，人们可以更深层的了解遗传信息的构成和传递途径（图1A）。近年，科学家在人类癌症细胞中发现一种四重螺旋体DNA分子——G-四链体(G-quadruplex)。它是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四分体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体（图1B）。

有研究表明，G-四链体更多的出现在癌细胞等快速分裂的细胞中，与癌基因的启动子区域和DNA链的端粒区域相互作用。因此，G-四链体结构与DNA复制过程有着紧密联系，对于细胞分裂和增殖非常关键[1]。那么，通过靶向调控G-四链体结构将有望成为选择性YZ癌细胞增殖的新途径，G-四链体也成为了癌症ZL药物的重要靶标。

图1.A：James Dewey Waston（左）& Francis Harry Compton Crick（右）

B：G4-DNA的3D结构

鉴于G4-DNA参与到很多生物过程当中，开发用于检测和可视化细胞中 G4-DNA 结构的工具也尤为重要。伦敦帝国理工学院的研究人员开发了一种能够在活细胞中检测G4-DNA的荧光探针——DAOTA-M2，为人们揭开了这种结构的神秘面纱 [2]。

这种探针具备良好的活细胞渗透性和低细胞毒性，在与G4-DNA结合时会发出荧光，可以用来观察G4-DNA是如何与活细胞内的其他分子相互作用的。并且当DAOTA-M2与不同的核酸拓扑结构结合时，将显示出不同的荧光寿命信息，进而可以区别双螺旋DNA和G4 DNA（图2），因为与四链体结合时荧光寿命更长（图3）。

图2. 荧光寿命置换测定的示意图：竞争对手结合后，DAOTA-M2 从 G4-DNA 转移到 dsDNA环境，导致其荧光寿命缩短

图3 DAOTA-M2染色的活细胞U2OS细胞核DNA的FLIM分析（a）以 512 × 512 分辨率（λex=477 nm，λem=550–700 nm）记录的荧光强度图像，红线表示用于 FLIM 分析的核分割（b） 来自 a 的 FLIM 图，显示在平均寿命 (τw) 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间（c） 平均核强度与平均核寿命（蓝点）的二维相关性（d）单个原子核的放大 FLIM 图 - 颜色代表寿命，由 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间的颜色梯度条定义

G4-DNA的生物功能是通过动态的折叠和打开实现。在细胞内，G4-DNA可以自发折叠，但其打开是由专门的解旋酶来完成。并且在接下来的研究中，科学家发现哺乳类动物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表达量减少将会导致DAOTA-M2荧光寿命变长（图4）[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2荧光寿命的变化监测G4-DNA在活细胞中的动态变化。

图4，减少 FancJ或RTEL1 解旋酶表达如何导致更长的 DAOTA-M2 寿命 (τw)的示意图

G4-DNA被认为是潜在癌症ZL药物靶点，因此评估给定的 G4-DNA靶向药物与该结构结合的能力将非常有用。通过不同处理后DAOTA-M2的荧光寿命变化，结果显示双羧酸功能化的Ni（Ni-salphen）与G4-DNA有很强的靶向结合能力，会在短时间内导致DAOTA-M2荧光寿命迅速下降。（图5）

图5. 加入结合剂1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像结果（显示在 6ns（红色）和 14ns（蓝色）之间）共孵育后 使用 DMSO（对照）、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺：20 μm

在以上的科研工作中，不难发现，JZ的检测方法是必不可少的，比如贯穿于整篇文献中的FLIM技术。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，荧光寿命成像）：是一种基于荧光寿命的显微成像技术，其成像结果提供像素位点的寿命信息，使得我们在荧光强度成像之外，能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点，如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON荧光寿命成像系统，搭载新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高灵敏度专用检测器，提供超快速、多维度荧光寿命成像解决方案。

将特异性探针与FLIM相结合使用，不仅可以用来监测活细胞细胞核中G4-DNA的形成，以及判定小分子药物与G4-DNA的相互作用，还可以应用于G4-DNA靶向药物的筛选。这些信息将为癌症的诊断和ZL带来了新启示，更有助于靶向性新疗法新药物的开发。

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