荧光定量PCR实验，荧光标记怎么选？

荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以此实现对初始模板的定量分析。荧光定量PCR技术作为当今生物学研究的重要手段之一，在基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等多方面具有广泛的应用前景。

说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为探针法和染料法两大类。

染料法

染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量（图 1）。SYBR Green I的吸收约在497 nm，发射波长约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。

▲ 图1 染料法原理图

理论上，所有能与双链DNA结合的染料都可以用于qPCR检测，如溴化乙锭EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而选择用于qPCR反应的染料通常会从信号强度、生物安全性、检测简便性和经济适用性这几个因素考虑。例如EtBr可能存在潜在的致癌性。综合考虑下来，SYBR Green I成了比较理想的选择。目前，使用Evagreen的实验者也越来越多，Evagreen作为一种新型的染料，其光谱性质与SYBR Green I类似，其优势在于：

▶  对PCR反应的抑制程度小。高浓度SYBR Green I会强烈抑制PCR反应，因此要控制其使用浓度，一定程度上降低了DNA检测的灵敏度。

▶ 与DNA结合密度高。单位长度的DNA双链上Evagreen的密度更高，为饱和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高检测灵敏度的同时也可用于高分辨率溶解曲线HRM。

▶  化学性质更稳定，适合长期保存。

TaqMan 探针

TaqMan 探针基本可以满足60%以上的qPCR实验，如常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端（图2）。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

▲ 图2 Taqman探针

MGB探针

对于要分辨单碱基差异的SNP实验，采用对碱基错配容忍度更低的MGB探针，在淬灭基团后加入了DPI3基团（图3），从而提高了与靶标结合的亲和力；而且可以对靶点碱基进行化学修饰，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。

▲ 图3 MGB探针

双杂交探针

Taqman探针对探针的长度有比较严格的要求，双杂交探针则消除了这一“缺陷”。双杂交探针是由两条寡核苷酸单链组成，一条的3’端带有供体荧光分子，另一条的5’端带有受体荧光分子（图4）。游离状态下荧光供体会发出荧光，但当两条单链都匹配到模板链上时，就会发生荧光共振能量转移FRET，受体荧光分子就可以发出荧光，其荧光强度与生成的产物的量成正比。双杂交探针的优势有两点：摆脱了探针长度的限制，较长的探针可以提高与模板匹配的成功率；只有上下游两条探针都正确匹配后才能检测到受体荧光分子发出的荧光，特异性有所提高。

▲ 图4 双杂交探针

分子信标探针

游离状态下，分子信标探针是一种茎环结构，其环状部分的15-30个碱基可以与靶标区域相结合匹配，下端的配对区域（左右一般各5-6个碱基）则由重复的GC组成，从而将5’的荧光分子和3’的淬灭基团紧紧聚在一起，荧光发生淬灭；当退火时，分子信标探针解开环并与模板靶标杂交，这样荧光分子和淬灭基团的物理距离就变大了，荧光淬灭的前提就打破了（图5）。除了MGB探针，分子信标探针也非常适合用于SNP检测。

▲ 图5 分子信标探针

除了上述几种类型的探针之外，还有尝试将引物和探针功能相结合的技术，如Amplifluor、LUX等，在设计难度上有所提高，但使用时更简便。各有其应用的侧重点和设计上的利弊，在此不多赘述。那么在荧光定量PCR实验中，我们应该如何进行选择呢？在这里，给大家总结了一些两种方法的区别，供大家参考。

表1 染料法和探针法的区别

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荧光定量PCR特点：现代分子生物学研究中的重要工具

荧光定量PCR（qPCR，Quantitative Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于定量分析特定DNA或RNA序列的实验技术。近年来，随着生物医学研究的迅猛发展，荧光定量PCR已成为分子生物学中不可或缺的工具。其独特的优势，如高灵敏度、精确度和实时监控等，使其广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、基因拷贝数检测以及病原微生物检测等多个领域。本文将深入探讨荧光定量PCR的主要特点，并分析其在现代分子生物学研究中的重要性和应用前景。

一、实时监控与高灵敏度

荧光定量PCR的大特点之一是能够实时监控PCR反应过程中的DNA扩增情况。在传统PCR中，扩增结果通常通过凝胶电泳检测，而荧光定量PCR则通过荧光染料或荧光探针实时检测PCR产物的增加量，从而可以在扩增的每一个循环中获取数据。这一过程不仅能提供定量数据，还能精确地反映每个样本中目标基因的初始浓度。

荧光定量PCR具有极高的灵敏度，能够检测到极低浓度的DNA或RNA样本。即使是微量的基因或病原微生物，也可以通过这种方法实现准确的定量分析，这对于早期诊断和低拷贝数基因检测至关重要。

二、广泛的应用领域

荧光定量PCR的应用范围极为广泛，涵盖了从基础研究到临床应用的多个领域。在基因表达研究中，qPCR被广泛用于分析特定基因在不同条件下的表达水平变化。通过比较不同样本中目标基因的表达量，研究人员可以揭示基因调控的机制和与疾病发生的关系。

在临床诊断中，荧光定量PCR也发挥了重要作用。例如，病毒载量的检测、癌症相关基因突变的检测等，均可通过qPCR进行定量分析。荧光定量PCR还可用于检测病原体，如细菌、病毒等微生物的感染水平，从而为疾病的早期诊断和提供可靠的依据。

三、快速高效且具有高精确性

荧光定量PCR的另一个显著特点是其高效性。与传统的PCR方法相比，qPCR不仅能够在较短时间内完成实验，还能通过使用专门的荧光探针或染料，提高对特定DNA或RNA序列的检测精度。不同于传统PCR仅能提供阳性或阴性的结果，荧光定量PCR能量化每个样本的扩增过程，提供更加详细的数据，确保实验结果具有更高的可靠性。

这种高效性和精确性使得荧光定量PCR成为了临床实验室、研究机构以及生物技术公司日常工作中的工具。通过精确控制每一个PCR周期，荧光定量PCR能够有效减少实验中的误差，提高实验结果的可重复性。

四、定量化与高通量检测

随着大规模筛选和高通量数据分析的需求不断增加，荧光定量PCR技术也在高通量检测中发挥着越来越重要的作用。通过多重PCR反应，研究人员可以同时检测多个目标基因，这大大提高了实验的通量和效率。荧光定量PCR的定量化能力使其在基因组学、转录组学等高通量分析中，成为了数据采集的核心技术。

五、结论

荧光定量PCR凭借其高灵敏度、实时监控、高精度及广泛的应用领域，已成为分子生物学研究和临床诊断中的重要工具。其在基因表达分析、病原检测、基因突变筛查等方面的优势，使其在科研和临床工作中扮演着至关重要的角色。随着技术的不断发展，荧光定量PCR的应用前景将更加广阔，为生命科学领域带来更为深远的影响。