荧光定量PCR检测报告单 怎么看

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荧光定量PCR试剂

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既然仪器已经备好了，那么该怎样选择检测方法呢？

众所周知，qPCR依托于荧光检测技术，通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增，从而对目的基因进行定量分析。为了避免在实验时出差错，下面就跟着小编一起来看一下常用的经典方法吧~

1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法

•  原理：SYBR Green I 是一种DNA结合染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强，DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此，检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。

•  特征：可逆荧光，Z大吸收波长497nm，Z大发射波长520nm。

•  适用情况：非特异性的荧光染料，不能识别特定的双链，只要是双链（包括非特异性扩增产物、引物二聚体等）就会结合发光，在临床上使用可能会有假阳性发生。但该方法容易建立实验体系，可进行熔点分析，通用性好，价格相对较低，在科研中使用比较普遍。

2 、TaqMan 探针法

•  原理：检测时除了需要一对特异性引物外，还需要一条与靶序列互补配对的寡核苷酸链—TaqMan探针，其5’末端包含荧光报告基团R，3’末端为淬灭基团Q。当探针与靶序列互补配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。荧光信号和产物的量相匹配。

•  特征：检测到的是积累荧光，随着循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

•  适用情况：特异性较强，可进行多重qPCR分析，但成本较染料法要高一些，实验构建相对复杂。常用的荧光基团推荐：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信标(molecular beacon)

•  原理：分子信标方法在检测时除了需要一对引物以外，还需要一条呈发夹结构的寡核苷酸探针（25-40nt），分子信标的 5'端附有荧光报告基团，3'端附有淬灭基团，环被设计成与靶序列互补的15–30核苷酸，其两端各有5-7个核苷酸互补形成茎结构，将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中，由于报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，当环的部分与核酸序列互补配对，分子信标打开成链状，使得荧光基团与淬灭剂分开，发射荧光。

•  特征：茎环结构，也是积累荧光。

•  适用情况：高特异性、可以用于多重反应，适合区分等位基因。但不能做熔点分析；发夹的茎结合过强过弱都不合适，过强的话，信标不能与靶标正确杂交，过弱的话，会随机折叠成非发夹结构，导致产生杂信号。常用的荧光基团有FAM 、Texas Red等。

4  、荧光共振能量传递(FRET)

•  原理：FRET探针又称双杂交探针，由两条相邻探针组成。一个探针3'端带有供体基团，第二个探针的5'端带有受体基团，在PCR反应的退火步骤，两条探针头尾相连地分别杂交在靶标序列上，荧光分子接近，从供体到受体产生荧光共振能量传递，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例。

•  特征：由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非积累荧光。

•  适用情况：除引物外需要设计两条探针，通用性不高；需挑选合适的供体及受体基团，供体基团发射波长与受体基团的激发波长需显著重叠，而供体基团发射波长与受体基团的发射波长要明显分离。可做熔点分析，特异性较强。

5 、 LUX Primers

•  原理：LUX (light upon extention) 引物是通过荧光标记的引物，使引物可以实现探针的功能。其原理和分子信标类似，LUX引物也是发夹结构，其中一条引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。

•  特征：积累荧光；不需要额外设计探针。

•  适用情况：不能进行熔点分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要专门设计探针，同时不会受非特异性扩增产物和引物二聚体的影响，特异性较SYBR Green I强。

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荧光定量PCR特点：现代分子生物学研究中的重要工具

荧光定量PCR（qPCR，Quantitative Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于定量分析特定DNA或RNA序列的实验技术。近年来，随着生物医学研究的迅猛发展，荧光定量PCR已成为分子生物学中不可或缺的工具。其独特的优势，如高灵敏度、精确度和实时监控等，使其广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、基因拷贝数检测以及病原微生物检测等多个领域。本文将深入探讨荧光定量PCR的主要特点，并分析其在现代分子生物学研究中的重要性和应用前景。

一、实时监控与高灵敏度

荧光定量PCR的大特点之一是能够实时监控PCR反应过程中的DNA扩增情况。在传统PCR中，扩增结果通常通过凝胶电泳检测，而荧光定量PCR则通过荧光染料或荧光探针实时检测PCR产物的增加量，从而可以在扩增的每一个循环中获取数据。这一过程不仅能提供定量数据，还能精确地反映每个样本中目标基因的初始浓度。

荧光定量PCR具有极高的灵敏度，能够检测到极低浓度的DNA或RNA样本。即使是微量的基因或病原微生物，也可以通过这种方法实现准确的定量分析，这对于早期诊断和低拷贝数基因检测至关重要。

二、广泛的应用领域

荧光定量PCR的应用范围极为广泛，涵盖了从基础研究到临床应用的多个领域。在基因表达研究中，qPCR被广泛用于分析特定基因在不同条件下的表达水平变化。通过比较不同样本中目标基因的表达量，研究人员可以揭示基因调控的机制和与疾病发生的关系。

在临床诊断中，荧光定量PCR也发挥了重要作用。例如，病毒载量的检测、癌症相关基因突变的检测等，均可通过qPCR进行定量分析。荧光定量PCR还可用于检测病原体，如细菌、病毒等微生物的感染水平，从而为疾病的早期诊断和提供可靠的依据。

三、快速高效且具有高精确性

荧光定量PCR的另一个显著特点是其高效性。与传统的PCR方法相比，qPCR不仅能够在较短时间内完成实验，还能通过使用专门的荧光探针或染料，提高对特定DNA或RNA序列的检测精度。不同于传统PCR仅能提供阳性或阴性的结果，荧光定量PCR能量化每个样本的扩增过程，提供更加详细的数据，确保实验结果具有更高的可靠性。

这种高效性和精确性使得荧光定量PCR成为了临床实验室、研究机构以及生物技术公司日常工作中的工具。通过精确控制每一个PCR周期，荧光定量PCR能够有效减少实验中的误差，提高实验结果的可重复性。

四、定量化与高通量检测

随着大规模筛选和高通量数据分析的需求不断增加，荧光定量PCR技术也在高通量检测中发挥着越来越重要的作用。通过多重PCR反应，研究人员可以同时检测多个目标基因，这大大提高了实验的通量和效率。荧光定量PCR的定量化能力使其在基因组学、转录组学等高通量分析中，成为了数据采集的核心技术。

五、结论

荧光定量PCR凭借其高灵敏度、实时监控、高精度及广泛的应用领域，已成为分子生物学研究和临床诊断中的重要工具。其在基因表达分析、病原检测、基因突变筛查等方面的优势，使其在科研和临床工作中扮演着至关重要的角色。随着技术的不断发展，荧光定量PCR的应用前景将更加广阔，为生命科学领域带来更为深远的影响。