sds-page电泳能检测蛋白的纯度吗

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  饭桶877 2018-04-01 18:07:28

  （以下方法仅供参考） 溶液配制 1 Tricine凝胶buffer 称取SDS 0.3g，Tris 36.5g，用浓盐酸调pH至8.45，定容至100mL。4℃保存，1个月内使用。 2 5M HCL 浓盐酸稀释2.4倍，室温保存，1个月内使用。 3 49.5% Arc/Bis，3%C凝胶贮液 称取48g丙烯酰胺，1.5g甲叉双丙烯酰胺，蒸馏水溶解并定容至100mL。4℃保存，1个月内使用。 4 50%甘油 取50mL甘油，加蒸馏水至100mL。室温保存，1个月内使用。 5 10％过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵10g，蒸馏水溶解并定容至100mL，分装成1.2mL/支。-20℃保存，一年内使用。 6 正极缓冲液 称取 Tris 24g，用800mL蒸馏水溶解，1M HCL调pH至8.9，定容至1L。4℃保存，一个月内使用。 7 负极缓冲液 称取Tris 12.1g，Tricine 17.9g，SDS 1g，加水溶解，定容至1L。2-8℃保存，半个月内使用。 8 非还原型样品缓冲液（2×） 量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚兰20mg、十二烷基硫酸钠0.4g、甘油2mL，加蒸馏水溶解并稀释至10mL，冷冻保存，一年内使用。 9 考马斯亮兰染色液 称取考马斯亮兰R-250 0.25g，加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸馏水45mL，混匀即成，室温保存，1个月内使用。 10 脱色液 取甲醇450mL、冰醋酸100mL、注射用水450mL，混匀，室温保存，3个月内使用。 实验流程 1 凝胶模具的组装与检漏 取1.0mm厚度的长短玻璃板，清洗干净后组装模具。注：短板朝里，若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。模具组装完成后，沿长短玻璃板之间形成的空隙加入注射用水直至水加满，平放模具。30S后，若液面不下降，则倒掉模具中的水，侧立模具并用滤纸吸干长短玻璃板间的注射用水。若模具漏水，则重新组装模具。 2Tricine SDS-PAGE 凝胶配制 （1）配制下层胶： 16.5%分离胶 10mL 注射用水 0.68mL Tricine 凝胶Buffer 3.4mL 49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 3.4mL 50%甘油 2.72mL TEMED 5μl 10%AP 100μl （2）配制上层胶： 5%浓缩胶Buffer 6mL 注射用水 3.6mL Tricine 凝胶Buffer 1.24mL 49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 0.4mL TEMED 6μl 10%AP 60μl 先配制下层胶，按下层胶配方依次加入相应溶液后，立即混匀（尤其是加入TEMED和10%AP时动作要快），倒入准备好的凝胶模具中，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝胶上方轻轻加入蒸馏水，水封。20min凝胶聚合后，倒掉模具中水封用的蒸馏水，侧立模具，用滤纸吸干模具中的水，但不要接触到下层胶。再配制上层胶，向模具内倒入上层胶至满，插上1.0mm厚度的梳齿。20min凝胶聚合后，拆下模具托盘，将装置放于电泳槽中，向玻璃板之间加入负极液至漫过短板，在外侧尽量多地加入正极液，双手均匀用力拔出梳齿。注：负极液必须漫过短板，正极液加入时不要和负极液相通。 2 电泳 将样品与对照品用注射用水稀释至1mg/mL，取30uL与2×非还原型上样缓冲液30uL以1：1混合，煮沸2min，点样量20μl/孔（双复孔）。 分子量标准65℃预热5min，点样量10μl。恒流35mA，约2-3h结束。 3 染色和脱色 将电泳后的凝胶浸入装有染色液的容器中，于摇床上低速震荡染色约30min，然后更换为脱色液，于摇床上低速震荡脱色至背景全无。 数据处理 用Quantity one 分析软件分析电泳图片，计算出电泳纯度

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