实时荧光定量PCR仪与基因扩增仪一样吗？有哪些区别

实时荧光定量PCR数据中的基本概念：

在整个扩增过程中会出现基线期，指数期，线性期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长，但是在基线期我们没办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的CT值就成了计算模板含量的关键值。

▲ 图一：线性图谱

▲ 图二：对数图谱

为什么知道CT值就能够得到最初的目标基因含量呢？

如图三，表示一个基因单次扩增曲线。N为扩增产物的分子数，模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物的分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此PCR理论方程只在指数期成立，也就是图三绿色框的部分。

▲ 图三

数据处理：

以下三张图分别表示我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线、标准曲线、溶解曲线。

1、juedui定量：使用一系列稀释的已知浓度的标准品与未知样本同时进行测定，根据系列浓度标准品的CT值与起始模板量之间的线性比例关系。

注意事项：

☑  标准品必须来源可靠，浓度已知。

☑  标准品要和待测样品同时在仪器中扩增。

☑  只能根据标准品覆盖的浓度范围进行待测样本浓度的推测。

2、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品之间的表达差异或目标在不同时相差的表达差异，也就是倍数差异。

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荧光定量PCR特点：现代分子生物学研究中的重要工具

荧光定量PCR（qPCR，Quantitative Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于定量分析特定DNA或RNA序列的实验技术。近年来，随着生物医学研究的迅猛发展，荧光定量PCR已成为分子生物学中不可或缺的工具。其独特的优势，如高灵敏度、精确度和实时监控等，使其广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、基因拷贝数检测以及病原微生物检测等多个领域。本文将深入探讨荧光定量PCR的主要特点，并分析其在现代分子生物学研究中的重要性和应用前景。

一、实时监控与高灵敏度

荧光定量PCR的大特点之一是能够实时监控PCR反应过程中的DNA扩增情况。在传统PCR中，扩增结果通常通过凝胶电泳检测，而荧光定量PCR则通过荧光染料或荧光探针实时检测PCR产物的增加量，从而可以在扩增的每一个循环中获取数据。这一过程不仅能提供定量数据，还能精确地反映每个样本中目标基因的初始浓度。

荧光定量PCR具有极高的灵敏度，能够检测到极低浓度的DNA或RNA样本。即使是微量的基因或病原微生物，也可以通过这种方法实现准确的定量分析，这对于早期诊断和低拷贝数基因检测至关重要。

二、广泛的应用领域

荧光定量PCR的应用范围极为广泛，涵盖了从基础研究到临床应用的多个领域。在基因表达研究中，qPCR被广泛用于分析特定基因在不同条件下的表达水平变化。通过比较不同样本中目标基因的表达量，研究人员可以揭示基因调控的机制和与疾病发生的关系。

在临床诊断中，荧光定量PCR也发挥了重要作用。例如，病毒载量的检测、癌症相关基因突变的检测等，均可通过qPCR进行定量分析。荧光定量PCR还可用于检测病原体，如细菌、病毒等微生物的感染水平，从而为疾病的早期诊断和提供可靠的依据。

三、快速高效且具有高精确性

荧光定量PCR的另一个显著特点是其高效性。与传统的PCR方法相比，qPCR不仅能够在较短时间内完成实验，还能通过使用专门的荧光探针或染料，提高对特定DNA或RNA序列的检测精度。不同于传统PCR仅能提供阳性或阴性的结果，荧光定量PCR能量化每个样本的扩增过程，提供更加详细的数据，确保实验结果具有更高的可靠性。

这种高效性和精确性使得荧光定量PCR成为了临床实验室、研究机构以及生物技术公司日常工作中的工具。通过精确控制每一个PCR周期，荧光定量PCR能够有效减少实验中的误差，提高实验结果的可重复性。

四、定量化与高通量检测

随着大规模筛选和高通量数据分析的需求不断增加，荧光定量PCR技术也在高通量检测中发挥着越来越重要的作用。通过多重PCR反应，研究人员可以同时检测多个目标基因，这大大提高了实验的通量和效率。荧光定量PCR的定量化能力使其在基因组学、转录组学等高通量分析中，成为了数据采集的核心技术。

五、结论

荧光定量PCR凭借其高灵敏度、实时监控、高精度及广泛的应用领域，已成为分子生物学研究和临床诊断中的重要工具。其在基因表达分析、病原检测、基因突变筛查等方面的优势，使其在科研和临床工作中扮演着至关重要的角色。随着技术的不断发展，荧光定量PCR的应用前景将更加广阔，为生命科学领域带来更为深远的影响。

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既然仪器已经备好了，那么该怎样选择检测方法呢？

众所周知，qPCR依托于荧光检测技术，通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增，从而对目的基因进行定量分析。为了避免在实验时出差错，下面就跟着小编一起来看一下常用的经典方法吧~

1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法

•  原理：SYBR Green I 是一种DNA结合染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强，DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此，检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。

•  特征：可逆荧光，Z大吸收波长497nm，Z大发射波长520nm。

•  适用情况：非特异性的荧光染料，不能识别特定的双链，只要是双链（包括非特异性扩增产物、引物二聚体等）就会结合发光，在临床上使用可能会有假阳性发生。但该方法容易建立实验体系，可进行熔点分析，通用性好，价格相对较低，在科研中使用比较普遍。

2 、TaqMan 探针法

•  原理：检测时除了需要一对特异性引物外，还需要一条与靶序列互补配对的寡核苷酸链—TaqMan探针，其5’末端包含荧光报告基团R，3’末端为淬灭基团Q。当探针与靶序列互补配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。荧光信号和产物的量相匹配。

•  特征：检测到的是积累荧光，随着循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

•  适用情况：特异性较强，可进行多重qPCR分析，但成本较染料法要高一些，实验构建相对复杂。常用的荧光基团推荐：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信标(molecular beacon)

•  原理：分子信标方法在检测时除了需要一对引物以外，还需要一条呈发夹结构的寡核苷酸探针（25-40nt），分子信标的 5'端附有荧光报告基团，3'端附有淬灭基团，环被设计成与靶序列互补的15–30核苷酸，其两端各有5-7个核苷酸互补形成茎结构，将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中，由于报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，当环的部分与核酸序列互补配对，分子信标打开成链状，使得荧光基团与淬灭剂分开，发射荧光。

•  特征：茎环结构，也是积累荧光。

•  适用情况：高特异性、可以用于多重反应，适合区分等位基因。但不能做熔点分析；发夹的茎结合过强过弱都不合适，过强的话，信标不能与靶标正确杂交，过弱的话，会随机折叠成非发夹结构，导致产生杂信号。常用的荧光基团有FAM 、Texas Red等。

4  、荧光共振能量传递(FRET)

•  原理：FRET探针又称双杂交探针，由两条相邻探针组成。一个探针3'端带有供体基团，第二个探针的5'端带有受体基团，在PCR反应的退火步骤，两条探针头尾相连地分别杂交在靶标序列上，荧光分子接近，从供体到受体产生荧光共振能量传递，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例。

•  特征：由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非积累荧光。

•  适用情况：除引物外需要设计两条探针，通用性不高；需挑选合适的供体及受体基团，供体基团发射波长与受体基团的激发波长需显著重叠，而供体基团发射波长与受体基团的发射波长要明显分离。可做熔点分析，特异性较强。

5 、 LUX Primers

•  原理：LUX (light upon extention) 引物是通过荧光标记的引物，使引物可以实现探针的功能。其原理和分子信标类似，LUX引物也是发夹结构，其中一条引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。

•  特征：积累荧光；不需要额外设计探针。

•  适用情况：不能进行熔点分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要专门设计探针，同时不会受非特异性扩增产物和引物二聚体的影响，特异性较SYBR Green I强。

【以上内容来源于网络整理，侵删】

看完了上面关于经典qPCR检测方法的介绍，您是不是有想去跑一轮qPCR的冲动呢？

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