等密度梯度分离实验中所需的氯化铯溶液如何配制？

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  回眸一群豿 2008-08-07 00:00:00

  一般情况下一管溶液在其溶质的溶解过程中或完全溶解之后，其在溶剂中的密度分布是不同的，在溶液尚未达到完全混合的均匀状态之前，单位尺度上存在的密度的差值，即为密度梯度。可以表示为：（密度2-密度1）/（密度2的位置坐标-密度1的位置坐标） 连续梯度 1、 测量DNA溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl， 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。 2、 每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表层）与DNA－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度大约740μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。 3、 室温下用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000rpm离心5min， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。 4、 用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。 5、 以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h（VTi65 转头）、 以45 000rpm离心48h（Ti50转头）、以60 000rpm离心24h（Ti65转头）或者以60 000rpm离心24h（Ti70.1转头）。普通光照下，在梯ZX可见两条DNA区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）DNA和带切口的环状质粒DNA组成：下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物，位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个DNA区高产水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个DNA区带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使DNA达到平衡。 6、 收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头（其斜面向上）插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封住皮下注射针头的末端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头（18号），将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。 等密度离心法 1．原理 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，Z后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr／dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 2．注意点： ①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头 ③粒子密度相近或相等时不宜用 ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 ⑤不能用刹车 四、梯度溶液的制备 (一)梯度材料的选择原则： 1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。 3．不会对离心设备发生腐蚀作用。 4．容易纯化，价格便宜或容易回收。 5．浓度便于测定，如具有折光率。 6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。 (二)梯度材料的应用范围 下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。 1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其Z高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 3．氯化铯：是一种离于性介质、水溶性大，Z高密度可达1．91g／nd。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 4．卤化盐类：KBr和NaCI可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 5．Percoll: 是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP)，渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的。其粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。 五、分析性超速离心 与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。 分析性超速离心的工作原理： 分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子，一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接一个高速的驱动装置，这轴可使转于在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳二个小室：分析室和配衡室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收(如对蛋白质和DNA)或折射率的不同对沉降物进行监视，后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液时，在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产生一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。

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