求教：水中铁的测定方法，要用邻菲罗啉作为显色剂，用分光光度仪测量

邻菲啰啉法采用邻菲啰啉分子吸收光谱法测定铁含量，本方法适用于含Fe0.02～20mg/L范围工业循环冷却水中铁含量的测定。

1、方法提要

用抗坏血酸将试样中的三价铁离子还原成二价铁离子，在pH2.5～9时，二价铁离子可与邻菲啰啉生成橙红色络合物，在ZD吸收波长（510nm）处，用分光光度计测其吸光度。本方法采用pH4.5。

2试剂和材料

2.1硫酸；

2.2硫酸铁铵[NH4Fe(SO4)2·12H2O2]；

2.3硫酸：1＋35溶液；

2.4氨水：1＋3溶液；

2.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液(pH=4.5)：称取164g乙酸钠，溶于水，加84mL冰乙酸，稀释至1000mL；

2.6抗坏血酸：20g/L溶液；溶解10.0g抗坏血酸于200mL水中，加入0.2g乙二胺四乙酸二钠（EDTA）及8.0mL甲酸，用水稀释至500mL，混匀，贮存于棕色瓶中（有效期一个月）；

2.7邻菲啰啉溶液：2.0g/L；

2.8过硫酸钾溶液：40.0g/L，溶解4.0g过硫酸钾于水中并稀释到100mL，室温下贮存于棕色瓶中，此溶液可稳定放置14d。

2.9铁标准溶液Ⅰ：1mL含有0.100mgFe,称取0.863g硫酸铁铵，精确至0.001g，置于200mL烧杯中，加入100mL水，10.0mL浓硫酸，溶解后全部转移到1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

2.10铁标准溶液Ⅱ：1mL含有0.010mgFe，取1mL含有0.100mgFe的铁标准溶液Ⅰ稀释10倍，只限当日使用。

3仪器和设备?分光光度计：带有厚度为3㎝的吸收池。

4分析步骤

4.1工作曲线的绘制

分别取0mL（空白），1.00mL，2.00mL，4.00mL，6.00mL，8.00mL，10.00mL铁标准溶液Ⅱ于7个100mL容量瓶中，加水至约40mL，加0.50mL(1＋35)硫酸溶液，调pH接近2(可投加一小块儿刚果红试纸，试纸变蓝pH即为2.5)，加3.0mL抗坏血酸溶液，10.0mL缓冲溶液，5.0mL邻菲啰啉溶液。用水稀释至刻度，摇匀。室温下放置15min，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，相对应的Fe3＋离子量（μg）为横坐标绘制工作曲线。

4.2测定

4.2.1总铁的测定

试样的分解：取5.0～50.0mL水样于100mL锥形中(体积不足50mL的要补水至50mL)，加1.0mL(1＋35)硫酸溶液，加5.0mL过硫酸钾溶液，置于电炉上。缓慢煮沸15min，保持体积不低于20mL，取下冷却至室温，用(1＋3)氨水或(1＋35)硫酸溶液调pH接近(可投加一小块儿刚果红试纸，试纸变蓝pH即为2.5)2，备用。吸光度的测定：将已调好pH值的试料全部转移到100mL容量瓶中，加3.0mL抗坏血酸溶液，10.0mL缓冲溶液（此时刚果红试纸应为红色，若不是红色证明缓冲液有问题，需要重新配置），5.0mL邻菲啰啉溶液，用水稀释至刻度。于室温下放置15min，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度。4.2.2可溶性铁的测定?取5.0～50.0mL经中速滤纸过滤后的水样于100mL锥形瓶中，以下按总铁的测定步骤进行。

5分析结果的表述

5.1以mg/LFe2＋表示的试样中总铁含量（ρ1）按下式计算：

p1=m1/V1

m1——从工作曲线上查得的以μg表示的Fe2＋量；V1——移取水样的体积，

5.2以mg/LFe2＋表示的试样中可溶性铁含量（ρ2）按下式计算：

p2=m2/V2

菲罗门色谱柱选择卡

菲罗门与ACE色谱柱的保养方法

色谱柱是一种消耗品，因此使用寿命有限。

对于大多数应用，色谱柱应持续进行500-2000次注射（进样），但这会因样品的清洁度、流动相的pH值和保护柱卡套的使用（是否使用保护柱）而不同。

这里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅胶基质）色谱柱的使用寿命。

一、色谱柱的平衡：当从一个流动相更换为另一个流动相时，或者在回收梯度（梯度循环）时，应需要10-20个柱体积。

下表显示了各种色谱柱尺寸（规格）的色谱柱体积。

如果溶剂的变化不太剧烈（例如80％至20％的ACN/水与ACN至THF（与之相对的由ACN至THF）），则需要的体积较少。

检查平衡Z简单方法是进行两次样品注射。

如果保留相同，则色谱柱充分平衡；如果保留变化，应增加平衡体积并重新试验。平衡与溶剂的体积有关，与时间无关。

所以较高的流量（流速）可以减少平衡时间。

                                        近似的色谱柱容量（mL）

二、色谱柱冲洗是一个简单的过程，可以通过清洗色谱柱中的顽固（保留较强的）物质来延长色谱柱的寿命。

每天结束色谱柱的使用时，应除去一切缓冲液（应除去色谱柱中的缓冲盐），然后用100％强溶剂（通常为ACN或MeOH，采用反相方法）冲洗色谱柱。

下一页列出的详细冲洗程序可以有效恢复色谱柱的性能，但应牢记：色谱柱是一种消耗品，因此请勿期望它能够永远的持续使用！

避免用100％的水冲洗反相色谱柱（嵌入极性基团或“AQ”色谱柱除外），因为相（固定相）去湿会影响清洗效果，而且流动相色谱柱的重新平衡会非常缓慢。

对于您的色谱柱，请按照以下所述的一般步骤，使用特定溶剂进行色谱柱冲洗。

应在冲洗之前查看制造商的建议（生产商说明书），以免损坏色谱柱。
1. 拆掉并翻转色谱柱（拆下色谱并反接）
2. 将色谱柱连接到泵上，而非检测器（不接检测器）
3. 用10-20个柱体积的溶剂进行冲洗，且流速不得高于QC色谱图的流速
4. 如果改变以下步骤，应确保在每个连续步骤中使用可混溶溶剂（溶剂可互溶）

反相色谱柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流动相无缓冲液
b. MeOH或ACN

如果金属离子被认为是污染的致因，应使用0.05M EDTA水溶液冲洗，然后用水冲洗，并按上述顺序冲洗。使用离子对试剂的色谱柱应专门用于离子对的应用之中。

未键合的硅胶柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

键合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

阴离子交换柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

阳离子交换柱（SCX，WCX）
a. 水（冲洗时注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白质的体积排阻柱
对于弱保留的蛋白质
a. 0.1M磷酸盐缓冲液，pH为3
对于强保留的蛋白质
a. 100％水至100％ACN的梯度，运行60分钟

三、色谱柱的合理存放有助于延长柱的使用寿命。

Z简单的存放步骤为：从柱中除去一切缓冲液，然后用10-20个柱体积的强流动相溶剂（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的顽固（强保留）物质。

然后用制造商指定的存储流动相，以10-20个柱体积的容量冲洗色谱柱（该信息应随色谱柱提供，并在QC检测色谱图中进行详细的说明）。

Z后，安全地盖上柱帽（拧紧堵头），以防流动相蒸发。
除了色谱柱制造商明确建议的特定情况（例如一些离子交换柱）外，请勿使用缓冲液或者少于约25％的有机溶剂来用于储色谱柱存储，因为它们会导致微生物的滋生。（保存色谱柱，以防微生物的滋生）

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。
随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。

随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。