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- 一只小鸟5711 2016-12-31 00:00:00
- 高中: 原理: 1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。 2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。 方法步骤: 1.提取细胞核物质:顺时针方向搅拌,稍快,稍重。 5 min 2.溶解DNA: 3.析出含DNA的黏稠物:蒸馏水300mL,逆时针方向搅拌,缓慢 4.过滤:取黏稠物 5.再溶解:顺时针方向搅拌,较慢。3 min 6.过滤:取滤液。 7.提取出含杂质较少的DNA,逆时针方向搅拌,稍慢。5 min 8.DNA的鉴定:沸水浴5min 大学 DNA提取分为三个基本步骤,每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA结合的组蛋白。 将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。 另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。 2.细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞;③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。 3.DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为YZ组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. (2).阴离子去污剂法; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA (3).苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时YZ了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 (4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,Z后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
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