天然疏水相互作用色谱与多角度光散射联用优化大肠杆菌全长SARS-CoV-2核衣壳蛋白的制备

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天然疏水相互作用色谱与多角度光散射联用优化大肠杆菌全长SARS-CoV-2核衣壳蛋白的制备

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的核衣壳蛋白（NP）在病毒生命周期的几个阶段中具有重要作用，并且在感染过程得到大量表达，使其成为诊断过程中理想的靶蛋白。该蛋白质具有强烈的二聚化以及与核酸相互作用的趋势。

细胞匀浆通过核酸酶处理和一系列下游处理 (DSP) 步骤获得纯化。天然疏水相互作用色谱法与多角度光散射检测（HIC-MALS）联用的分析方法可以监测整个纯化过程中样本的碎片化和多聚化。优化后的工艺可以让每升样本发酵生产730mg纯化的NP，相当于细胞裂解产率的77%。HIC-MALS方法证明了NP 产品的生产纯度可以达到 95%。通过尺寸排阻与多角度激光光散射检测技术联用（SEC-MALS）系统分析进一步证实NP主要部分的分子量与二聚蛋白一致。肽图质谱和宿主细胞特异性酶联免疫吸附测定证实了产品的纯度，残留杂质为少量内源性物质。优化后的HIC-MALS方法可以监测产品纯度，同时获取其分子量，并提供与已有的SEC-MALS分析方法互补的正交信息。通过扩展变量来调整HIC模式中的选择性，可以在SEC上实现更高的分辨率。

普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，由于该多糖独特的结构和性质，在医药、食品、石油、化工等行业具有广泛的应用前景。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。

本应用是将HLC-8420GPC凝胶渗透色谱系统和LenS3多角度光散射检测器联用，采用TSKgel GMPWXL色谱柱对普鲁兰多糖标准品的绝 对分子量、分子量分布及回转半径 (Rg) 进行了表征。

分析条件

仪器:  HLC-8420GPC & LenS3

色谱柱: TSKgel GMPWXL (7.8mmI.D.×30cm, 13μm)

流动相:  0.1 M NaNO3

流速:  1.0 mL/min

样品浓度:  1.095 mg/mL

进样量:  100 μL

温度:  40℃

样品:  普鲁兰多糖

分析结果

图1  多检测器测试谱图

（紫色曲线为示差(RI)检测器信号，红色曲线为10°角光散射(LALS)检测器信号，蓝色曲线为90°角光散射(RALS)检测器信号，绿色曲线为170°角光散射(HALS)检测器信号）

图2 绝 对分子量、回转半径(Rg)及RI随流出时间曲线

（紫色曲线为示差(RI)检测器信号，绿色曲线为绝 对分子量，蓝色为回转半径(Rg)随流出时间曲线）

图3  分子量分布和累积分布曲线

（黄色曲线为分子量分布曲线，紫红色曲线为累积分布曲线）