什么是实时荧光定量PCR？有什么作用？请详细说明。

实时荧光定量PCR数据中的基本概念：

在整个扩增过程中会出现基线期，指数期，线性期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长，但是在基线期我们没办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的CT值就成了计算模板含量的关键值。

▲ 图一：线性图谱

▲ 图二：对数图谱

为什么知道CT值就能够得到最初的目标基因含量呢？

如图三，表示一个基因单次扩增曲线。N为扩增产物的分子数，模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物的分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此PCR理论方程只在指数期成立，也就是图三绿色框的部分。

▲ 图三

数据处理：

以下三张图分别表示我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线、标准曲线、溶解曲线。

1、juedui定量：使用一系列稀释的已知浓度的标准品与未知样本同时进行测定，根据系列浓度标准品的CT值与起始模板量之间的线性比例关系。

注意事项：

☑  标准品必须来源可靠，浓度已知。

☑  标准品要和待测样品同时在仪器中扩增。

☑  只能根据标准品覆盖的浓度范围进行待测样本浓度的推测。

2、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品之间的表达差异或目标在不同时相差的表达差异，也就是倍数差异。

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既然仪器已经备好了，那么该怎样选择检测方法呢？

众所周知，qPCR依托于荧光检测技术，通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增，从而对目的基因进行定量分析。为了避免在实验时出差错，下面就跟着小编一起来看一下常用的经典方法吧~

1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法

•  原理：SYBR Green I 是一种DNA结合染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强，DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此，检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。

•  特征：可逆荧光，Z大吸收波长497nm，Z大发射波长520nm。

•  适用情况：非特异性的荧光染料，不能识别特定的双链，只要是双链（包括非特异性扩增产物、引物二聚体等）就会结合发光，在临床上使用可能会有假阳性发生。但该方法容易建立实验体系，可进行熔点分析，通用性好，价格相对较低，在科研中使用比较普遍。

2 、TaqMan 探针法

•  原理：检测时除了需要一对特异性引物外，还需要一条与靶序列互补配对的寡核苷酸链—TaqMan探针，其5’末端包含荧光报告基团R，3’末端为淬灭基团Q。当探针与靶序列互补配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。荧光信号和产物的量相匹配。

•  特征：检测到的是积累荧光，随着循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

•  适用情况：特异性较强，可进行多重qPCR分析，但成本较染料法要高一些，实验构建相对复杂。常用的荧光基团推荐：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信标(molecular beacon)

•  原理：分子信标方法在检测时除了需要一对引物以外，还需要一条呈发夹结构的寡核苷酸探针（25-40nt），分子信标的 5'端附有荧光报告基团，3'端附有淬灭基团，环被设计成与靶序列互补的15–30核苷酸，其两端各有5-7个核苷酸互补形成茎结构，将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中，由于报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，当环的部分与核酸序列互补配对，分子信标打开成链状，使得荧光基团与淬灭剂分开，发射荧光。

•  特征：茎环结构，也是积累荧光。

•  适用情况：高特异性、可以用于多重反应，适合区分等位基因。但不能做熔点分析；发夹的茎结合过强过弱都不合适，过强的话，信标不能与靶标正确杂交，过弱的话，会随机折叠成非发夹结构，导致产生杂信号。常用的荧光基团有FAM 、Texas Red等。

4  、荧光共振能量传递(FRET)

•  原理：FRET探针又称双杂交探针，由两条相邻探针组成。一个探针3'端带有供体基团，第二个探针的5'端带有受体基团，在PCR反应的退火步骤，两条探针头尾相连地分别杂交在靶标序列上，荧光分子接近，从供体到受体产生荧光共振能量传递，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例。

•  特征：由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非积累荧光。

•  适用情况：除引物外需要设计两条探针，通用性不高；需挑选合适的供体及受体基团，供体基团发射波长与受体基团的激发波长需显著重叠，而供体基团发射波长与受体基团的发射波长要明显分离。可做熔点分析，特异性较强。

5 、 LUX Primers

•  原理：LUX (light upon extention) 引物是通过荧光标记的引物，使引物可以实现探针的功能。其原理和分子信标类似，LUX引物也是发夹结构，其中一条引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。

•  特征：积累荧光；不需要额外设计探针。

•  适用情况：不能进行熔点分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要专门设计探针，同时不会受非特异性扩增产物和引物二聚体的影响，特异性较SYBR Green I强。

【以上内容来源于网络整理，侵删】

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在普通PCR之外，每个产品，从单个PCR管、PCR八联排管到PCR板，都通过实时PCR应用测试。所有的PCR管和排管的盖子均设计能够使荧光信号通过，到达PCR仪光学检测单元。
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它极其透明的如玻璃般的区域，具有光学封板膜良好的特质，与封板膜相比，他们没有黏附的缺点，展示了较好的密封性，因此蒸发率极低。

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