未完全冷却对dna吸光度的测定是否有影响

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  小啦啦gg 2018-03-28 00:00:00

  影响DNA合成的实验结果的因素 1、 偶联效率对总产量的影响 无论采用何种纯化方法，从一个失败的合成中得到纯的寡核苷酸是不可能的。可以用分光光度法测定495nm的吸光度来准确地计算出合成的偶联效率，这是由于每个循环中末端核苷酸5’—OH的脱保护产生橘黄色吸收，这种颜色产生于DMT阳离子的释放，对测定每一步的偶联效率非常有用。 在一个成功的合成中，从一个循环到下一个循环间，由于不完全偶联和未反应链的封闭所引起的颜色强度的下降非常小。偶联效率愈高，产率愈高，一定偶联率下，随着片段的延长，寡聚脱氧核苷酸的每步得率逐步下降。 采用优质的试剂，在设计合理的DNA自动合成仪上平均偶联率可以达到99．5％，且仍有余地增加寡核苷酸合成的偶联率。如果日常平均偶联率可达到99．5％以上，DNA链的合成可超过200个核苷酸。 2、 固相寡核苷酸合成的局限性对总产量的影响 虽然DNA合成效率高，但是杂质不可避免地要积累。合成一个20mer的寡聚脱氧核苷酸，要包含100多个单独的化学步骤，每一步骤都有产生不必要的副反应的可能性。除了不完全的偶联所引起的失败片段的积累，去嘌呤化后的寡核苷酸链切除也可产生截去末端的片段。 有时会出现碱基杂环的化学修饰，修饰的寡核苷酸产物可能是诱变剂，在生物学实验中容易引起严重的问题。由于副反应的出现，要得到很高纯度的寡核苷酸，必须应用很好的纯化方法进行纯化。

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