Alpha助力DNA甲基化表型调控新发现

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

Nature上一项新的研究揭示了一种跨染色质调节途径，即NSD1（一种组蛋白甲基转移酶）介导的H3K36me2是在基因间区域招募DNMT3A和维持DNA甲基化所必需的，并将异常的基因间CpG甲基化与人类肿瘤生长和过度发育相关联在一起。

作者发现了一个有趣的现象：塔顿布朗拉赫曼综合征(Tatton–Brown–Rahman syndrome, TBRS)是一种儿童过度生长障碍，是由生殖系统DNMT3A（DNA甲基转移酶3A）突变导致的。儿童期巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)是由NSD1（组蛋白甲基转移酶）的单倍剂量不足引起的。这两种疾病具有相同的临床特征，这就非常有意思了：这预示着组蛋白修饰和DNA甲基化修饰可能存在机制上的关联性。

首先，研究人员通过全基因组分析和ChIP-seq分析方法发现，组蛋白甲基化修饰H3K36me2和H3K36me3的富集区域非常类似，且明显区别于其他组蛋白甲基化修饰如H3K9me3和H3K27me3所划分的区域。而且H3K36me2和H3K36me3水平与CpG甲基化呈正相关，这与之前报道的H3K36me3介导靶向DNMT3B的活性一致。然而，由于这种相互作用于基因小体，染色质水平上的调控机制并不清楚。

在进一步的检测和比较全基因组分析，发现H3K36me3在基因体中表现出特征性的富集，而H3K36me2则表现出更为弥散的分布，包括基因区和基因间区。与H3K36me3相比，DNMT3A选择性富集在H3K36me2高水平区域。

接下来，就是我们的独 家法宝Alpha技术大显身手的时候了。研究人员采用体外高灵敏度、匀相免疫AlphaLISA技术来阐明H3K36me2介导的DNMT3A募集特异性背后的机制。首先GST标记DNMT3A，纯化后将GST-DNMT3A与生物素化的核小体（不同甲基化的H3K36）置于384孔板。依次加入谷胱甘肽受体微珠，链霉亲和素供体微珠。避光反应60min后置于Envision多模式读板仪中对信号进行检测。

通过亲和曲线分析可得知，DNMT3A与H3K36me2修饰的核小体的亲和力Z高，其次是H3K36me3，但不与其他价态结合。这些结果表明DNMT3A可以识别H3K36两种甲基化状态，但对H3K36me2的亲和力更强。

同时，作者也在体外NSD1突变细胞和临床Sotos综合症病人的血样本中验证组蛋白H3K36甲基化与DNA甲基化修饰的相关性，揭示DNMT3A优先选择H3K36二甲基化区域，促进基因间区的DNA甲基化。这一机制在疾病发生过程中有潜在的生物学意义。

珀金埃尔默公司一如既往的为用户提供客制化Alpha Assay检测试剂和高品质的检测设备：

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参考文献

Weinberg D N, Papillon-Cavanagh S, Chen H, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape[J]. Nature, 2019, 573(7773): 281-286.

Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. Lancet. 2018

阿尔兹海默氏病（Alzheimer disease，AD）是一种进行性疾病，涉及大脑神经元退化，并导致各种症状，Z显著的是记忆力丧失。科学家们多年来一直致力于在此疾病的发病机制、诊断、ZL等方面开展研究，力求解决这个威胁人类健康安全的世纪难题。

β-粥样淀粉一直被科学家认为是Alzheimer's disease (AD)疾病的起因。而γ分泌酶作为一种膜蛋白酶，可以直接或间接的产生各种amyloid peptide (Aβ) ，所以以γ分泌酶为靶点的机制和应用研究也Z多。Presenilin早老素，作为γ-secretase四个亚基之一的催化亚基，负责β-amyloid (Aβ)肽的产生，超过200 Alzheimer’s 疾病相关的突变在presenilin 1 (PS1) and PS2中被确认。但有趣且有争议的是，这些相关的AD疾病突变在γ-secretase其他三个亚基中并没有发现。这预示着早老素有别于γ-secretase的其他功能。为证实这一假设，找到与PS结合蛋白是非常重要的一步。

Alzheimer 新突破

近来，清华大学施一公团队在阿尔兹海默病发病机制上又有了新突破：首次发现可与Presenilin相互作用并具有水解功能的蛋白Bax-inhibitor 1 (BI1)。

研究发现，Bax-inhibitor 1 (BI1)，是一个进化保守的跨膜蛋白，可以稳定与PS1结合，但不与具完整亚基结构的γ-secretase结合。加入底物APP-C99，通过AlphaLISA检测Aβ40和Aβ42的产生情况，来进一步验证BI1的细胞功能。发现PS1–BI1复合物不具备水解酶活性。在等摩尔浓度下，BI1对γ-secretase的蛋白水解活性没有影响，但在将BI1提高200倍摩尔的条件下，γ-secretase蛋白水解活性减少了一半。

AlphaLISA方法检测PS1–BI1复合物对APP-C99的水解活性

这直接预示了PS1除了参与γ-secretase外，可能还具有其他的细胞功能。BI1是一种被认为在细胞凋亡和钙通道调控中起作用的蛋白，此研究结果直接将PS1与BI1联系起来，这一发现为研究PS1的功能和AD的发生提供了更多的可能性。

检测理想之选AlphaLISA

AlphaLISA匀相检测体系的突出特点是高通量、高信噪比、均相免洗、抗干扰能力强，操作简单。在体外、细胞、组织等水平的检测中，都显示出传统检测方法无法媲美的zhuo越性能。

ALPHA的方法采用单体氧作为能量扩散的载体，其扩散距离可以达到200nm，发光原理为化学反应发光，具有背景干净、信噪比高的特点，因此更适合于复杂样品的检测，如组织液、血清、组织裂解液等，步骤少、方法简单、均相反应、不需要洗涤，因此实验结果质量更高。同时推荐选择具有HTS ALPHA检测模块的多功能酶标仪进行抗体的筛选，可以大大缩短检测时间。

使用ALPHA的方法进行Aβ的检测是理想之选，可以通过商品化的Aβ检测剂盒检测Aβ的量：

Amyloid β 1-15

Amyloid β 1-40 (human)

Amyloid ß 1-40 (mouse/rat)

Amyloid β 1-42 (human)

Amyloid β 1-42 (mouse/rat)

Amyloid β 1-x

Amyloid β oligomers

Total or oligomerized Aβ 42 (Two in one)

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参考文献

1. Wu S, Song W, Wong CCL，et al.,(2019).Bax inhibitor 1 is a γ-secretase–independent presenilin-binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A. Jan 2;116(1):141-147.

2. Stéphanie Chasseigneaux,et al.,(2012). Functions of Aβ, sAPPα and sAPPβ : similarities and differences. J. Neurochem. 120 (Suppl. 1), 99–108.

3. Ting-Hai Xu, Yan Yan, Yanyong Kang, et al., (2016). Alzheimer’s disease-associated mutations increase amyloid precursor protein resistance to γ-secretase cleavage and the Aβ42/Aβ40 ratio. Cell Discovery. 2, 16026.

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珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

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大部分化疗药物如铂类药物等，都是通过破坏肿瘤细胞中的DNA来YZ细胞的生长，从而达到治LX果。然而，“聪明”的肿瘤可以采用另一种替代性的DNA跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)途径来完成复制并获得耐药性。针对TLS的靶向化ZL是非常有前景的开发方案。

来自麻省理工学院和杜克大学的研究人员发现一种可阻断TLS途径的小分子化合物并发表在CELL上。同时，用这种化合物和顺铂联合ZL体外肿瘤细胞和荷瘤小鼠时，都有显著的效果。

这样有临床应用潜力的明星分子是如何被发现的呢？

在哺乳动物细胞中，TLS的发生包括两个步骤，首先插入TLS DNA聚合酶，如POL kPOL i、POL h或REV1，在损伤处引入一个核苷酸；接下来是募集b族聚合酶复合物POL z (POL z4: REV3L/REV7/POLD2/POLD3)进行3’端的延伸。而其中起主要作用的是约100个氨基酸的REV1 C-terminal domain (CTD)，它可以招募插入TLS的其他聚合酶POL k、POL i和POL h，并通过与REV7的相互作用来招募POL z。

基于此，作者首先分别构建了His8-tagged REV7/3和FLAG-tagged POL k RIR-REV1 CTD表达系统并对融合蛋白进行纯化，然后基于ELISA方法对化合物库中高达~10000种化合物进行筛选，并将目标锁定了JH-RE-06。

然后作者采用高灵敏定量AlphaScreen技术，通过抗FLAG供体微珠、抗His受体微珠构建匀相反应体系，进一步确定了化合物JH-RE-06对REV1-REV7的阻断作用，并得出了其IC50值为0.78 mM。

随后，作者在分别在多种人类癌细胞和人类黑色素瘤小鼠模型上进行了验证，证实此化合物可以提高癌细胞对顺铂类化合物的敏感性和长期化疗的有效性，并对其他以DNA为作用靶标的类似药物，都有同样的类似效果。

作者用清晰的思路论述了筛选和验证化合物的过程，并进一步讨论了化合物耐药性机制：JH-RE-06能与Rev1结合并生成二聚体，而一旦形成这样的二聚体结构，则不能与Rev3 / Rev7 TLS DNA聚合酶结合，直接阻止了TLS的发生和癌细胞的快速复制，同时，也更进一步制止了突变产生的可能性，避免了癌细胞获得耐药性。

在整个实验过程中，采用ALPHA技术对初筛得到的化合物JH-RE-06的功能验证是非常重要的一步：

ALPHA的方法采用单体氧作为能量扩散的载体，其扩散距离可以达到200nm，发光原理为化学反应发光，具有背景干净、信噪比高的特点，同样适合于复杂样品的检测，如组织液、血清、组织裂解液等，步骤少、方法简单、均相反应、不需要洗涤，因此实验结果质量更高。同时推荐选择具有HTS ALPHA检测模块的多功能酶标仪进行抗体的筛选，可以大大缩短检测时间。

参考文献

Jessica L. Wojtaszek, Nimrat Chatterjee, et al. ;(2019).A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy. Cell. 178, 1–8,June 27

    在今日《科学》的论文中，André Nussenzweig研究团队以有丝***后的神经元和巨噬细胞为研究体系，发现DNA主动去甲基化对于增强子激活是必要的，并且解释了神经元和巨噬细胞增强子上DNA单链损伤的来源以及阐述其中的机制。

    据研究者介绍，在哺乳动物细胞中，5-甲基胞嘧啶（5mC）是***主要的DNA修饰，它对于发育和细胞分化有重要作用。5mC可被TET酶氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），引起DNA去甲基化。

    在DNA主动去甲基化过程中，5fC和5caC被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）切除产生无碱基位点，并后续产生DNA单链损伤。其能通过碱基切除修复（BER）途径***终修复转化为C碱基。

    根据过往研究数据，研究者推测单链DNA损伤可能与TET-TDG介导的5fC/5caC切除有关。利用细胞工程获得的兴奋性神经元（iNeuron），研究者降低了细胞TDG水平，结果发现此行为可让神经元中可以积累大量的5fC/caC。

    随后，研究者利用课题组开发的DNA单链损伤检测技术发现，降低TDG水平几乎消除了DNA单链损伤。这也说明，神经元中DNA单链损伤来源于TDG依赖的DNA主动去甲基化。

▲研究示意图（图片来源：Active DNA demethylation damages DNA，DOI: 

    除了在神经细胞增强子上观察到重复出现的DNA损伤修复事件，研究者还使用了由前体B细胞转分化来源的巨噬细胞作为测试对象。通过CRISPR/Cas9敲除TET2和TDG蛋白，研究者也在巨噬细胞中发现了主动去甲基化引起的DNA单链损伤和修复过程。

    不过两者也有着略微的区别，巨噬细胞偏好使用短补丁碱基切除修复（short-patch BER）以填补单核苷酸断裂缺口，而神经元会同时使用长补丁碱基切除修复 （long-patch BER）和短补丁碱基切除修复。

    根据论文，TDG缺失不会影响巨噬细胞和神经细胞的分化，却会在分化过程中让数千种基因的表达发生变化。这对细胞的行为是有影响的，例如TDG缺失削弱了巨噬细胞吞噬细菌的能力。而TDG被敲除，会部分影响神经元分化成熟相关基因的表达上调，包括神经突触前信号通路调控的相关基因。

    研究者指出，新研究发现的机制对于肿瘤治有一定启示意义。在DNA 主动去甲基化过程中，若使用抗肿瘤胞嘧啶类似物（Ara-C）中断DNA修复会触发 TDG 依赖性DNA损伤应答和神经元死亡，这表明神经元在正常分化和分化成熟后内在的生理活动可能会导致化疗造成的神经损伤。

    André Nussenzweig课题组博士后王东鹏，吴薇（兼共同通讯作者，现为中科院分子细胞科学***创新中心研究员）和研究科学家Elsa Callen为该论文的共同***作者。

    现阶段核酸检测是分析疾病的重要手段，洛阳吉恩特生物giant-bio自主研发生产的纳米核酸提取磁珠（DNA/RNA提取磁珠） 磁响应时间迅速，提取效率高，可明显缩短实验时间，提高实验效率，并在提取结果上保持稳定,另外羧基磁珠和氨基磁珠也是制作免疫磁珠的重要原料。