直播回顾 | 抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘

4月20日上午，徕卡与转化医学网共同举办了网络研讨会——“抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘”。徕卡生命科学部的高级应用专员刘继红和Cell DIVE应用科学家Michael Smith为广大观众揭示了CELL DIVE 超多重标记解决方案如何轻松应对复杂的肿瘤微环境，为临床肿瘤的研究和治 疗提供了优秀的研究工具。Indica Labs应用科学家赵永田重 点介绍了在HALO中对获取的Cell DIVE图像的处理、分析步骤以及如何进行高纬的空间生物学分析，用以了解肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用关系对研究肿瘤免疫应答的作用机制。

01

CELL DIVE使用的抗体是开放的吗？有大约多少种经过验证的抗体？

A：CELL DIVE 的抗体是开放的，有350种以上的抗体经过验证的抗体可以使用。

02

CELL DIVE可以在临床上用吗，是否有注册证？

A：目前没有注册证，正在申请中。

03

这个平台的检测联系哪位呢？

A：可以联系Leica公司各地的应用支持和销售。

04

这个染色是仪器自动染色吗？

A：可以手动染色也可以和自动染色仪联用自动染色。

05

哪个实验室可以检测？

A：Leica公司有DEMO机，可以提供一定的演示。

06

成像是全片还是一个视野？

A：成像仪可以选择全片成像或者选取一个或多个视野成像。

07

怎样避免非特异性染色 ？核阳性的和胞浆包膜可以随意搭配吗？

A：首先要选择特异性好的抗体，我们抗体库的抗体都是经过验证的抗体。

细胞核阳性和胞浆包膜理论上可以自由搭配。

08

每一轮染完了，除了染料失活，是不是还需要去除一抗？

A：每一轮染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。

09

CELL DIVE是不需要摸索一抗浓度的吗，固定的protocol会不会造成有的组织染不出来有的组织却染色过强？

A：徕卡的protocol适用于绝大多数的组织，有些组织的某个marker 表达特别高或者特别低，可能需要修改抗体浓度。

10

抗体是什么方法学检测标记？除了主讲人介绍的荧光滤镜，能否使用其他的荧光标记和滤镜？

A：抗体验证时参照同样marker的免疫组化的结果；为了减少串色的发生，我们推荐使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光谱基本相同的染料标记。

11

成像也是设备自动化进行的吗？

A：成像时设备自动进行的，但是可以在拍照前根据样本的染色情况进行优化。

12

Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）

A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.

13

关于细胞间邻近距离的分析，我们如何设定所计算的距离范围？

A：关于细胞间邻近距离的分析，所定义距离的范围目前还没有相应的标准。考虑到不同细胞亚型的相互作用，不同免疫细胞亚群之间邻近距离的设定可能需要不同的标准。在分析中，HALO可以对距离进行设定，并按照不同的区间（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）给出邻近细胞的数量和密度。分析中先进行预分析，根据不同距离范围内免疫细胞的密度和临床信息进行相关性分析。再把确定的距离应用到所用的样本切片中。

14

在分析过程中，我们可以选择局部视野进行分析吗？还是仅能对全组织切片进行分析？

A：分析中，我们建议针对全景组织切片进行分析，但HALO也可以定义ROI区域进行选择性的视野进行分析。这两种分析方法在HALO里都可以实现的。

本次网络课程的第.一期在7月4日结束了，此次直播在讲解知识的同时与大家进行了积极互动，并且收到了广泛的好评。

鞠焕鑫博士讲解的关于微区分析利器-SXI的使用秘笈，大家有没有Get到呢？以下是本次网络讲堂的课件：

细胞因子是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）中细胞通讯的关键介质，在癌症的发生、发展、治 疗和预后等多个方面发挥重要作用。在过去的 40 年中，细胞因子和细胞因子受体作为癌症靶点或癌症治 疗方法得到了广泛的研究。目前公认的临床前治 疗策略为增强干扰素和白细胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生长抑 制和免疫刺激作用，或抑 制细胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎症和促进肿瘤的作用[1]。

图 1 . 细胞因子在肿瘤微环境中的作用

特定细胞因子的表达也与肿瘤细胞的高存活率和高转移性密切相关。其中促炎细胞因子 IL-6 和 IL-8 与多种癌症相关，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌等 [2,3]。因此，分析细胞因子的表达是一种重要的诊断工具和预测癌症预后的关键因素。

非放射性的 RNA 原位杂交技术（ViewRNA ISH）是一种高灵敏度的检测细胞因子表达的有效方法，并且可以对 1 至 4 个 mRNA 目标进行多重分析。

检测原理如下图所示：

图 2 .  ViewRNA ISH 检测原理

安捷伦BioTek Cytation 5 多功能细胞成像微孔板检测系统，可容纳多达四个荧光通道同时成像，快速并出色地成多色荧光成像。仪器配备的高内涵分析软件可自动计算细胞内 RNA 的表达水平。Cytation 5 活细胞成像工作站结合ViewRNA ISH，为细胞因子研究提供了一种高效率、高灵敏度和可重复的检测方法。

实验案例分享

 实验一．细胞因子mRNA的成像和分析 

为研究细胞因子mRNA 在不同营养条件下的表达情况，设置两组对照实验。阳性对照细胞培养于完全培养基中，而阴性对照细胞经过 18 小时的血清饥饿处理。随后加入 ViewRNA 探针以标记 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分别使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道对探针进行成像完成 ISH 细胞分析。图像结果表明：细胞因子mRNA 的表达在营养匮乏的条件下会显著降低。

图 3 . 阳性和阴性对照组成像。HCT116 放大 20 倍图像作为（ A ）阳性对照和（ B ）阴性对照。MDA-MB-231 细胞放大 40 倍的图像作为（ C ）阳性对照和（ D ）阴性对照。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记 IL-8 mRNA ；橙色：标记 IL-6 mRNA ；红色：标记 ACTB mRNA 。

接下来为了定量分析细胞因子表达，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下进行细胞核计数，以确定每孔的细胞数量（图 4A ）。然后分别在GFP 、RFP 通道进行细胞因子探针（ IL-6 或 IL-8 ）的荧光信号分析（图 4B ）。通过细胞荧光信号的比率评估不同实验条件下的细胞因子表达（图 5 ）。

图 4 . 每个细胞的荧光信号分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 软件进行细胞分析圈选出 DAPI 标记的细胞核；( B ) 荧光标记的 IL-8 信号的图像分析。

如图 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合准确的量化了细胞内 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。

图 5 . MDA-MB-231 细胞中 IL-8 表达和 HCT116 细胞中 IL-6 表达，并以细胞数目进行校正。

 实验二．诱导细胞因子 mRNA 的表达 

使用不同剂量的 IL-1β 刺激 DU145 细胞，以分析细胞因子的 mRNA 的表达（图6）。图 7 结果显示：虽然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表达增加，但 IL-8 的表达变化更为显著，这与先前研究结果一致[4]。IL-1β 的最 高剂量下，这两种细胞因子的表达减少则是由于细胞毒性。这验证了该检测方法的可行性与稳定性。

图 6 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号 ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。蓝色：DAPI染色的细胞核；绿色：标记的IL-8 mRNA；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。

图 7 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下 DU145 细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。

 实验三．抑 制细胞因子 mRNA 的表达 

研究表明丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可调节 IL-8 ，并证明用 MAPK/ERK 抑 制剂 U 0126 治 疗可减少 DU145 和 MDA-MB-231 细胞中的炎症细胞因子[4,5]。为了确认这一现象并验证 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合的能力，将不同浓度的 U 0126 加入到每种细胞类型中孵育 30 分钟。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 细胞达 3 小时，而 MDA-MB-231 细胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道进行细胞计数和图像分析以评估在 U 0126 治 疗后 IL-8 和 IL-6 细胞因子 mRNA 的表达。采集的图像（图 8 ）和计算的荧光信号强度 （图 9 ）证实了 U 0126 的抑 制作用。此外，也验证了该方法的灵敏度，可以准确识别给予抑 制剂后 mRNA 的表达变化。

图 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表达。图像显示了在不同浓度的 U 0126 处理后 ( A-E ) MDA-MB-231 细胞内 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号；( F-J ) 为 DU145 细胞。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记的 IL-8 mRNA ；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。

图 9 . U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 细胞中的表达

结 语

ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 细胞分析试剂盒和探针提供一种灵敏的方法来检测 mRNA 表达。该方法在安捷伦BioTek Cytation 5 细胞成像系统的加持下得以更更快地采集多荧光通道的图像，并更精 准的计算出每一个细胞的荧光信号强度。这种检测、成像和分析的完 美结合提供了一种灵敏、灵活和高通量的方法用以检测细胞因子 mRNA 的表达。

参考文献：

[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.

[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.

[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.

[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.

[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18. 

介绍和目标

免疫系统对癌症治 疗的反应可以反映患者在治 疗之后是否会有良好的结果。了解肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生和治 疗反应中的变化对制定个性化的治 疗方案并改善癌症治 疗至关重要。借助稳定和全面的超多标成像技术，可使用免疫标志物探查髓系和淋巴系细胞的谱系和结构，而且结合特定肿瘤生物标志物时，还可以捕捉多种肿瘤中TME内的免疫反应。细胞类型特征模式，结合超多标组织成像的探查能力，可以针对免疫细胞群和TME内众多类型细胞的空间相互作用提供之前无法获得的全新认识。

Cell DVE超多标成像分析整体解决方案可以使用循环染色和染料失活流程对一个完整组织切片上的数十个生物标志物进行检测和成像。Cell DIVE的核心是一个精确、灵活、开放的多标记成像解决方案，可以灵活选择多标记成像研究中常用的生物标志物抗体。Cell Signaling Technology(CST)拥有丰富的经IHC验证的抗体组合，可检测TME中的关键蛋白质，实现组织中的免疫细胞检测和表型判断。CST提供抗体偶联物，这些偶联物均经过验证，可用于Cell DIVE上，并提供经IHC验证抗体与荧光团和其他检测试剂的定制化偶联。CST采用严格的IHC验证方法，随后还会在Cell DIVE平台上进行验证，可确保成功检测蛋白质。

在本研究中，我们展示了使用由数十种CST生物标志物抗体™组成的新型检测模式，在多种组织类型中进行的Cell DIVE超多标成像。多标记检测模式的开发所需的优化极少，可识别复杂的细胞类型，并揭示肿瘤微环境中的细胞间相互作用。

结 果

表征肿瘤微环境有助于理解导致患者预后不佳的新机制。肿瘤微环境比较复杂，通常在单个样本和不同患者样本中都是异质的。循环多标记染色和成像可在不同组织样本中实现TME探查，即使可用组织有限的情况下。在这项研究中，我们检查了12个完整组织或TMA切片中30多个生物标志物的表达（表1），重 点是潜在的免疫治 疗目标、预测性生物标志物和分割标志物。所有的CST生物标志物抗体均被连接并随机分配到一个回合。

表1.研究设计：抗体和组织

为了在TME中其他细胞的背景下定义免疫细胞，融合并分割了所有的生物标志物图像，并使用聚类分析和降维（UMAP）对表达进行分析。聚类分析提供了一个无偏见的方法来定义组织内的免疫细胞贡献。

在这项研究中，我们展示了人类结肠腺癌（CAC；图1）的聚类分析。在这里，聚类分析将白细胞从所有其他上皮细胞和基质细胞类型中区分出来（图1C）。此外，聚类清楚地定义了淋巴细胞和骨 髓细胞类别。CAC中的骨 髓类亚型包括骨 髓祖细胞、M2巨噬细胞和另外两个未知亚型的骨 髓聚类。其他生物标志物可用于进一步定义亚型。对于淋巴类，定义了T细胞和NKT细胞聚类。另外，还确定了一个具有CD20阳性的T细胞聚类。使用机器学习进行单细胞表型分析，可以从聚类中进一步定义细胞类型。例如，在图像1D中，聚类15中的一个细胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（图1D-E；橙色圈）。聚类和单细胞空间分析被应用于研究中的所有其他组织（图2；数据未显示）。

图1：CST检测模式的多标成像可在一张玻片上检查结肠腺癌（CAC）组织的免疫细胞成分（图1 A）。用多种生物标志物对玻片进行反复染色和成像（表1；图1 A、B、D板）。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（1C-H所示为CAC，正常结肠组织未显示）。聚类15（图1D-F）被突出显示，一个跨生物标志物的特定细胞用一个橙色的圆圈突出显示（图1D）。降维（UMAP；图1G）表示免疫细胞和其他聚类之间的关系。

图2：CST检测模式在多种癌症和正常组织类型中的多标成像。玻片被反复染色和成像（表1；图2组织类型）。所有生物标志物显示在一张图像中。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（数据未显示）。组织特定的免疫细胞聚类是由特定的生物标志物表达模式统计出来的。在聚类之后，单细胞表型能够对聚类中的细胞群进行空间分析。

方法和材料

CST抗体经过了严格的验证，以确保抗体在FFPE组织上的表现。本研究中的所有抗体都是直接偶联或商业偶联物成品（表1）。偶联是使用非位点特异性化学方法进行的。抗体与四种不同的染料过量偶联，去除未结合的染料，并通过分光光度分析测量标记的程度。经过初步验证，具有最 佳标记程度和浓度的偶联抗体溶液随后用于对各种人类癌症组织和正常组织的染色。组织从商业来源获得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI对组织进行成像，并自动进行自发荧光去除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的专 利软件全拼接图像进行导入、融合和分析。

结 论

• 使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案，用30多种CST生物标志物抗体对12个完整的组织和TMA切片进行循环染色和成像。

•  这个CST检测模式能够识别含有不同免疫类别、细胞类型和亚型的细胞的集群。

• Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案可保存组织，未来进一步定义免疫细胞亚型的工作可以继续使用同一组织切片上的其他CST抗体，并与研究中所有先前的生物标志物叠加。

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超多标组织成像分析整体解决方案Cell DIVE

11月4日，瑞沃德“沃”在前沿·免疫治疗专家论坛直播圆满落幕！本期论坛有幸邀请到3位专家做客瑞沃德直播间，期间老师们不仅针对肿瘤免疫治疗的相关内容进行了分享，同时围绕肿瘤免疫治疗新方向展开精彩讨论，在线观看人次3000+，共同探讨免疫治疗在肿瘤领域的最 新进展及发展趋势。

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继3月3日学习了新发布36项兽药残留之喹诺酮类的检测方法后，3月10日小伙伴们又如约来到坛墨直播间，聆听四环素类药物残留的检测关键点：

首先，秦老师带领大家分析了四环素类兽药的结构特点：

接着对比了四环素类相关检测标准在适用范围，提取溶剂，净化柱等方面的区别；最后重点介绍了新国标GB 31656.11和GB 31658.6两个标准前处理过程中需要注意的关键细节。

新发布36项兽药残留检测标准解读系列（三）

课题

新发布36项兽药残留检测标准解读系列（三）

直播间的小伙伴们都非常的积极，纷纷提出自己检测过程中遇到的问题，秦老师一一给与了详细的解答。

Q1: 配制四环素类标准品时的注意事项？

储存条件和保质期？

A: 由于四环素类兽药的热稳定性较差，见光易分解；建议不要配制太高浓度，防止析出；配制100 μg/mL标准储备液, -18℃ 以下避光保存，有效期1个月；混合标准工作液，2℃~8℃保存，现用现配。

Q2：样品前处理中加入乙腈后，样品成团，

能均质吗？如何避免成团？

A: 样品成团是因为蛋白质遇到有机溶剂变性所致；建议加入适量纯水，使样品形成糊状，然后再均质；后续的除水可以通过加入氯化钠或者无水硫酸镁进行盐析去除。

Q3: GB 31656.11四环素类测定，

加入醋酸铅后，依然难过柱，

如何更好地解决？

A: 重点是样品提取过程中把蛋白等杂质去除干净，需要充分地离心；建议离心时间稍微长一点，低温高速多次离心，快速过滤。

听完秦老师的技术分享，小伙伴们对坛墨产品的呼声也很高，研发张金龙经理对配套标准品进行了一一讲解，并给出了直播间最优的折扣。

如果还有疑问的同学可以在本条公众号下留言。感谢大家的参与，持续关注我们，下期再见哟~