深蓝云直播课堂： MIQE指南下数字PCR技术文章发表

目前，越来越多的领域都会用到数字PCR（dPCR）技术，但关于实验细节和结果评估缺少一个共识。在很多发表的文章中都缺乏足够的dPCR实验细节，这样不利于评审文章，甚至难以根据文章重复实验。

为了让大家更好地遵循MIQE进行实验，科学家依托于法国Stilla Technologies的Naica数字PCR平台发布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR™ for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通过6色荧光数字PCR技术检测了乳腺癌相关靶点，并借此阐述了整个数字PCR操作流程以及如何运用MIQE。

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PCR技术以特异性的寡核苷酸引物放大扩增特定的DNA片段，一对引物在单次反应扩增单个基因。通常每个靶标分别进行检测，即单重PCR反应，但当我们需要检测多个靶标基因时，单重PCR费时费力同时无法排除不同样品孔间的加样差异，如内参基因的归一化检测，需要在同一反应管中检测内参基因和目标基因，多重PCR实验无疑是最简单直接的解决方案。

多重PCR也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种PCR扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段。在荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（digital PCR）技术中，多重PCR设计配合多荧光通道可以进行更多靶标的相对于标准品的检测和直接的JD定量检测，既具有单重PCR的敏感性和特异性，同时又比单重PCR更加GX、快捷和经济。

多重PCR实验具体如何进行？又有哪些注意事项？实时荧光定量PCR和数字PCR如何和多重PCR结合？北京深蓝云生物科技有限公司云课堂将为您答疑解惑。

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基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

但是在CRISPR基因编辑之后，工作并没有结束，你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。想知道如何利用高灵敏度、高jingzhun度的数字PCR技术来检测基因编辑吗？快来参加本次深蓝云直播课堂吧！

对于做分子生物学实验的科研人员来说，引物探针是一个无比熟悉的词语。不管是普通的PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）还是灵敏度及jing准度更高的数字PCR（dPCR），高质量的引物和探针都是实验成功的关键。

然而想要获得的引物探针，得到一个好的实验结果也并非那么容易。好的实验结果千篇一律，不好的实验结果各不相同，可能一不小心就有了非特异性产物或者扩增不出产物等等。从实验小白到大神，不断地学习和摸索是少不了的。针对不同的PCR在引物和探针设计上又有哪些不同呢？如何评估设计的引物和探针的质量呢？为了让您少走弯路，深蓝云直播间与您在线交流如何获得更优的qPCR、dPCR引物及探针，为您的实验助一份力！

第三代PCR技术即数字PCR（digtal PCR）技术，可以实现对起始样品核酸的定量。在反应体系中加入荧光染料的同时将反应体系进行分区，实现单分子模板扩增，Z后通过阳性反应器数直接读出目标序列的拷贝数，可以对低拷贝基因进行检测，弥补了荧光PCR的不足。因其出色的灵敏度和精确度，数字PCR在检测微量核酸样本，稀有突变，拷贝数变异，复杂样品检测等方面均有广泛的应用前景。

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数字PCR课堂

为了方便大家更好的学习数字PCR技术，由法国Stilla Technologies公司开发的Gene-π数字PCR学堂为您全方位解读数字PCR技术，可以实现从新手到专家的进阶，适用于所有对数字PCR技术感兴趣的科学家。该平台为用户提供Z新的数字PCR技术信息，使用户能够学习数字PCR技术的基本知识。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。

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实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成为分子生物学研究不可或缺的一种技术手段，常见应用于基因表达分析、肿瘤疾病诊断、病原微生物检测、食品安全分析和动植物育种等。qPCR检测技术由于具有高灵敏度的特性，应尽量避免操作中的实验误差，确保获得可靠真实的数据。那么如何确保实验数据的可靠性和真实性，则需要通过对qPCR关键数据的评估来进行判断。除此之外，如何分析qPCR异常数据，也是每一位qPCR实验者需要经历的必要环节。

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直 播 课 

在之前发表的文章《实时荧光定量PCR检测方法，你选对了吗?》中提到，实时荧光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探针法、分子信标、荧光共振能量传递(FRET)和LUX Primers等。那么应用最为广泛的则是SYBR Green染料法和TaqMan探针法，两者各有所长。今天，先给大家介绍TaqMan探针法，它优秀在哪里？

TaqMan 探针法

最关键的Taqman探针，是一条与靶序列特异性结合的寡核苷酸序列，其能够结合到正反向引物结合区域的中间部位，随着PCR反应的进行，DNA聚合酶在延伸到探针位置时会将其水解，从而释放荧光基团，扩增产物产生信号。

TaqMan探针法的优势

☑  高特异性，只有在探针和靶标基因之间发生特异性的水解，才会生成荧光信号。

☑  多重分析，可选择不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测多个不同的序列。

☑  无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

探针序列的设计原则

1. TaqMan探针的长度zuihao不超过30bp。理想情况下，有15bp可获得ZJ特异性；

2. Tm值在67℃-72℃之间，确保探针的Tm值比引物的高5-10℃，在退火过程中优先结合到模板上；

3. 探针序列的GC含量在20％至80％之间，避免多个重复的碱基出现，尤其要避免4个或超过4个的G碱基；

4. 探针尽量避免出现二聚体或者发夹结构，以保证足够高的模板结合效率；

5. 探针5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

引物探针设计不再犯愁

深蓝云生物为您提供Gene-π网站在线设计引物探针，可为您快速设计引物探针并进行评估，复制链接可进行查询：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何选择荧光基团和淬灭基团

修饰基团的选择是探针法的重要环节，那么我们需要注意以下几项：

1. 根据荧光定量PCR仪荧光通道，选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA，自身会发出荧光信号，干扰检测结果，后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 进行多重qPCR检测时，每个通道要选择不同的荧光基团，且避免各标记基团的激发和发射波长重叠，出现荧光干扰的情况。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。

除此之外，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，可为您的科学研究就提供高jingzhun、高灵敏可靠结果。

☑   数据可靠性

连续1000次实验后，结果高度一致，温控jingzhun，性能稳定可靠。

☑  应用灵活性

提供多种qPCR应用分析，定制化报告。

☑   流程智能化

中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

☑   交互灵活性

主机可独立运行qPCR程序，电脑、Wi-Fi、网络交互。

生物通“2020生命科学十大创新产品评选”活动自启动以来，受到了各界广泛的关注。经过一个月的投票和专家评鉴，2020生命科学十大创新产品现已揭晓。这些产品或助力新冠病毒的检测，或从新的角度揭开生物学的复杂机制，有望推动基础研究和临床转化。

在同类型的产品中，经过层层筛选，深蓝云生物的新品：naica®微滴芯片式数字PCR系统，在同类产品中脱颖而出，获得2020生命科学十大创新产品大奖。

naica®微滴芯片式数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的拷贝数浓度，融合传统微滴式和芯片式优势，被称为下一代数字PCR技术。

显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。显微镜是人类最伟大的发明物之一，那么该如何使用显微镜呢？长期使用显微镜的小伙伴们，长期观察目镜筒是否会感到眼睛酸涩？想要分享视野中的发现时是否会困扰如何去跟别人描述新发现的位置？想要记录视野图像时是否需要反复的找合适角度拍照？

想要知道上面问题的解决办法吗？那就赶紧快来参加8月25日的深蓝云直播课堂吧！您想知道的答案都在本次课程里，come on！

直播课

2021年4月13日，深蓝云Gene-π数字PCR学堂——数字PCR病毒载量检测工具（北京站）在国家疾控ZX成功举办。为更好的服务于用户，本次培训班以理论结合实践的形式，聚焦数字PCR原理系统、实验操作、结果分析，病毒载量检测等核心内容，受到了用户的一致好评。

数字PCR技术的诞生和发展为核酸定量和核酸检测提供了全新的思路。无需标准品和标准曲线，可提供比qPCR的核酸定量，直接读取阳性信号，通过泊松分布校正得到目标基因的JD拷贝数，并具有高灵敏度等特点。

本次训练营对第三代数字PCR技术及naica®️微滴芯片式数字PCR技术介绍、naica®️数字PCR核酸JD定量技术中的病原体检测应用、病毒载体JD拷贝浓度数字PCR检测实验设计、特别是一步法数字PCR新冠病毒检测试剂盒的使用和结果判读等方面进行了详细介绍，同时进行实操。

▲ 专家在进行精彩的分享

▲ 实验操作

作为数字PCR头部企业技术开创者的法国Stilla Technologies公司于2019年提出数字PCR在线学习资源ZXgene-π学堂，为使用和即将使用数字PCR技术的专家学者提供有效的途径，同时开展Gene-π数字PCR线下实操培训课堂，为用户提供完善的服务以及优化的应用解决方案。

naica®微滴芯片式数字PCR系统

naica®微滴芯片式数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行JD定量。2.5小时内，可快速获得结果。

同学们又是做qPCR实验的一天，有没有怀着忐忑又期待的心情去点开“analysis”的呢？点开之后，发现扩增曲线不正常，或者Cq值过大，又或者SD值太高，那这样的实验结果还靠谱吗？现在让小编来告诉你，qPCR实验的成功与否，关键在于各组数据是否达到判定标准以及是否符合实验预期，小小的qPCR实验它可以变得很简单，也可以变得很复杂，如何抓住qPCR数据分析的关键，是分析qPCR结果可信度的diyi步。

qPCR数据分析的关键

qPCR数据分析主要是利用Cq值进行计算，所以我们需要了解qPCR反应中几个重要的参数，根据参数的表现来进行实验评估：

扩增曲线：图1反映的是荧光信号变化量的对数与qPCR反应循环数的关系。图2反映的是随着qPCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短。标准的扩增曲线是呈现出“S”型，具有特征性的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

图1：扩增曲线对数图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

图2：扩增曲线线性图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

基线：通常3-15个循环时，荧光信号变化不大，变化趋势接近于一条直线，即扩增曲线的水平部分，这样的直线就是基线。同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。

阈值：是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线，自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置是置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Cq值：qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时一般取Cq:15-35，太大或者太小都会导致定量的不准确。

图3：扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

评估qPCR反应的效果

1、扩增效率及相关系数

为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。扩增效率E在90-110%之间时，认为扩增接近理想情况。

R²值：评估PCR效率的另一个关键参数，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R²等于1，则可以用Y值（Cq）来准确预测X值（初始模板量）。反之，如果R²等于0，就不能通过Y值来预测X值。一般认为，标准曲线的R²值大于0.98时，两个数值之间相关的可信度很好。

图4：标准曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

2、重复性

重复性即是指精确度，反映多次测量值之间的接近程度。标准偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。例如，假设PCR反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Cq间隔应该恰为1个Cq值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。总的来说，重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

图5：8个重复孔的扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

3、重现性

指不同批次之间或不同实验室之间qPCR结果的变化，通常表示为拷贝数或Cq值的SD或CV。

图6：4台独立的Azure Cielo 仪器上检测GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、灵敏度

分析灵敏度是指一个样本中可通过实验精确测量的最小拷贝数，而临床灵敏度是指在特定疾病患者们中，被检测确定为阳性的百分比。灵敏度为limit of detection（LOD），即在给定的分析程序中，可以确定且合理（通常使用95%的概率）检测得到的浓度，可通过梯度稀释样品来确定ZD检测限。LOD理论上最小是3 copy/aliquot，这是由遵从泊松分布的取样误差导致的。假设符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和检测到1个拷贝。

图7：5个数量级的动态范围检测。图源：Azure Cielo qPCR系统。

5、准确度

反映测量值和真实值的接近程度，以倍数变化或拷贝数进行估算。

6、特异性

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

图8：溶解曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。该系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，可为您的科学研究就提供高jingzhun、高灵敏可靠结果。

Azure  Cielo™性能展示

☑   高重现性和稳定性

连续1000次实验后，结果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

☑  高重复性

重复孔的扩增曲线高度重合

96孔重复结果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

变异系数（Cv）=0.002。

☑   高分辨率

准确区分2倍浓度差异样品

人内参cDNA（GAPDH）进行10个梯度，

2倍稀释，3个重复，线性拟合度

R²=0.998，扩增效率E=99.89%

TaqMan探针法因其良好的特异性以及可多重检测而受到实验人员的青睐，其实除了探针法外，还有很多好的实验方法也被实验人员广泛认可，这次就介绍一下另一个应用广泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因为哪些优点获得实验人员的青睐呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，其不会与单链DNA结合，且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。

SYBR Green染料法优点

☑  通用性好，适合进行大多数类型的定量反应，可以进行熔解曲线的分析。

☑  无需设计探针，引物设计相对简单，不用考虑基团选择，易于上手；成本低，无需合成探针。

☑  无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

SYBR Green染料法缺点

SYBR Green染料法也有其缺点，SYBR Green染料法一个反应只能检测一个基因，无法进行二重甚至多重的实验。同样的相对于TaqMan探针法其特异性较差，当引物存在二聚体或者非特异性扩增时，染料同样可以结合并发出荧光，影响定量结果。因此对于SYBR Green染料法而言，设计一套好用的引物是重中之重。

深蓝云生物为您提供Gene-π网站在线设计引物，可为您快速设计引物并进行评估，复制链接可进行查询：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

设计好引物后，我们该怎么进行实验呢？

1.实验条件的优化

我们需要对设计的引物扩增效果进行分析，使用阳性模板进行扩增，确定扩增产物为单一条带，且大小符合设计预期，如有条件可以对扩增产物进行测序，保证准确性。当引物无问题后，进行反应条件的探索，对退火温度进行温度梯度检测，找到合适的退火温度，即PCR扩增效果好，阴性模板无扩增，条带单一，熔解曲线单峰等。

2.预实验

设计好引物并探索好实验条件后，对样本进行一次预实验，预实验将样本进行梯度稀释用以制作标准曲线，分析内参基因以及目的基因的扩增效率是否接近且在100%左右，其次可确认高浓度模板中是否有yizhi剂干扰，从而确定实验时合适的模板浓度（样本是否需要稀释或浓缩）。

3.正式实验

当我们完成了实验条件和预实验后就可以进行正式实验了，每个样品都需要3个或以上的重复，保证结果的准确性。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道两种机型，可根据实验需求灵活配置。

除此之外，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，可为您的科学研究就提供高jingzhun、高灵敏可靠结果。

☑   数据可靠性

连续1000次实验后，结果高度一致，温控JZ，性能稳定可靠。

☑  应用灵活性

提供多种qPCR应用分析，定制化报告。

☑   流程智能化

中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

☑   交互灵活性

主机可独立运行qPCR程序，电脑、Wi-Fi、网络交互。

2021年5月13日，深蓝云Gene-π数字PCR学堂——核酸JD定量分析及应用训练营（北京站）在北大YL创新谷成功举办。本次培训以理论结合实践的形式，聚焦数字PCR原理系统、实验操作、结果分析，在先进ZL中数字PCR技术的体系开发和标准物质的JD定量等核心内容，受到学员的一致好评。

数字PCR技术的诞生和发展为核酸定量和基因检测提供了全新的思路，可实现单细胞/单分子层面的JD定量。目前，该技术已经在肿瘤个体化诊疗、基因编辑、液体活检、病原微生物、先进的细胞ZL、基因ZL检测等前沿生命科学研究、临床医学检验、药物研发等多个领域实现突破性应用和发展。

本次训练营对第三代数字PCR技术及naica®️微滴芯片数字PCR技术介绍、naica®️ 微滴芯片数字PCR系统在核酸JD定量技术及先进ZL中的应用、在生物制品安全检测中的应用等方面进行了详细介绍，同时进行实操。

▲ 专家在进行精彩的分享

▲ 实验操作

naica®微滴芯片数字PCR系统

naica®微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行JD定量。2.5小时内，可快速获得结果。

您是否有过长时间观察显微镜而眼睛酸涩？您是否有过为观察玻片和培养皿而在两台显微镜之间奔波？您是否有过为观察传统显微镜繁冗操作而愁苦？

不必说明场全视野观察，高清晰显示，极简化操作；也不必说荧光模块自动转换，多通道荧光叠加，图像辅助编辑；单是正倒置一体式观察，就备受科研工作者的青睐。

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大家知道显微观察中，正置显微镜更适合于玻片观察、油镜观察；倒置显微镜则更适合于培养皿/培养瓶观察、孔板观察，不仅如此，往往还需要明场与荧光观察。因此，一台显微镜满足以上所有需要，就显得弥足珍贵。

直播课

做蛋白研究的小伙伴都知道，一个完整的Western Blot包括了很多个步骤，从蛋白提取到配胶、上样电泳，再到转膜、封闭，Z后孵育一抗二抗后才能进行检测。时间跨度非常长，而且这中间的每一步都包含了很多的小细节，稍有不慎就会导致结果出错，然后又得从头来过。所以，关于WB，几乎每一经验丰富的实验老手都有着一本厚厚的血泪史。