【深蓝云直播课】Echo显微镜使用技巧—Rebel

显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。显微镜是人类最伟大的发明物之一，那么该如何使用显微镜呢？长期使用显微镜的小伙伴们，长期观察目镜筒是否会感到眼睛酸涩？想要分享视野中的发现时是否会困扰如何去跟别人描述新发现的位置？想要记录视野图像时是否需要反复的找合适角度拍照？

想要知道上面问题的解决办法吗？那就赶紧快来参加8月25日的深蓝云直播课堂吧！您想知道的答案都在本次课程里，come on！

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您是否有过长时间观察显微镜而眼睛酸涩？您是否有过为观察玻片和培养皿而在两台显微镜之间奔波？您是否有过为观察传统显微镜繁冗操作而愁苦？

不必说明场全视野观察，高清晰显示，极简化操作；也不必说荧光模块自动转换，多通道荧光叠加，图像辅助编辑；单是正倒置一体式观察，就备受科研工作者的青睐。

尊重传统，勇于创新，来自ECHO公司的显微镜REVOLVE采用IPAD替代传统目镜，释放您的双眼；明场/荧光双相机双光源，提高观察效果；APP软件控制，简化显微操作；给您带来不一样的观察体验！

大家知道显微观察中，正置显微镜更适合于玻片观察、油镜观察；倒置显微镜则更适合于培养皿/培养瓶观察、孔板观察，不仅如此，往往还需要明场与荧光观察。因此，一台显微镜满足以上所有需要，就显得弥足珍贵。

直播课

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成为分子生物学研究不可或缺的一种技术手段，常见应用于基因表达分析、肿瘤疾病诊断、病原微生物检测、食品安全分析和动植物育种等。qPCR检测技术由于具有高灵敏度的特性，应尽量避免操作中的实验误差，确保获得可靠真实的数据。那么如何确保实验数据的可靠性和真实性，则需要通过对qPCR关键数据的评估来进行判断。除此之外，如何分析qPCR异常数据，也是每一位qPCR实验者需要经历的必要环节。

北京深蓝云生物科技有限公司为您答疑解惑，提供 “实时荧光定量PCR的关键数据及常见问题分析” 网络直播课。

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你想从Western Blot小白进阶到实验高手吗？想了解Z先进的数字PCR定量技术吗？想了解新冠病毒数字PCR检测方案吗？想知道不一样的正倒置一体荧光显微镜吗？想了解实时荧光定量PCR原理与分析方法吗？你想知道的问题都在深蓝云直播课堂。

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对于做分子生物学实验的科研人员来说，引物探针是一个无比熟悉的词语。不管是普通的PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）还是灵敏度及jing准度更高的数字PCR（dPCR），高质量的引物和探针都是实验成功的关键。

然而想要获得的引物探针，得到一个好的实验结果也并非那么容易。好的实验结果千篇一律，不好的实验结果各不相同，可能一不小心就有了非特异性产物或者扩增不出产物等等。从实验小白到大神，不断地学习和摸索是少不了的。针对不同的PCR在引物和探针设计上又有哪些不同呢？如何评估设计的引物和探针的质量呢？为了让您少走弯路，深蓝云直播间与您在线交流如何获得更优的qPCR、dPCR引物及探针，为您的实验助一份力！

目前，越来越多的领域都会用到数字PCR（dPCR）技术，但关于实验细节和结果评估缺少一个共识。在很多发表的文章中都缺乏足够的dPCR实验细节，这样不利于评审文章，甚至难以根据文章重复实验。

为了让大家更好地遵循MIQE进行实验，科学家依托于法国Stilla Technologies的Naica数字PCR平台发布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR™ for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通过6色荧光数字PCR技术检测了乳腺癌相关靶点，并借此阐述了整个数字PCR操作流程以及如何运用MIQE。

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PCR技术以特异性的寡核苷酸引物放大扩增特定的DNA片段，一对引物在单次反应扩增单个基因。通常每个靶标分别进行检测，即单重PCR反应，但当我们需要检测多个靶标基因时，单重PCR费时费力同时无法排除不同样品孔间的加样差异，如内参基因的归一化检测，需要在同一反应管中检测内参基因和目标基因，多重PCR实验无疑是最简单直接的解决方案。

多重PCR也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种PCR扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段。在荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（digital PCR）技术中，多重PCR设计配合多荧光通道可以进行更多靶标的相对于标准品的检测和直接的JD定量检测，既具有单重PCR的敏感性和特异性，同时又比单重PCR更加GX、快捷和经济。

多重PCR实验具体如何进行？又有哪些注意事项？实时荧光定量PCR和数字PCR如何和多重PCR结合？北京深蓝云生物科技有限公司云课堂将为您答疑解惑。

想要了解更多关于单重PCR和多重PCR实验设计的相关信息，快来参加5月13号的直播课堂吧！

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做蛋白研究的小伙伴都知道，一个完整的Western Blot包括了很多个步骤，从蛋白提取到配胶、上样电泳，再到转膜、封闭，Z后孵育一抗二抗后才能进行检测。时间跨度非常长，而且这中间的每一步都包含了很多的小细节，稍有不慎就会导致结果出错，然后又得从头来过。所以，关于WB，几乎每一经验丰富的实验老手都有着一本厚厚的血泪史。

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

但是在CRISPR基因编辑之后，工作并没有结束，你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。想知道如何利用高灵敏度、高jingzhun度的数字PCR技术来检测基因编辑吗？快来参加本次深蓝云直播课堂吧！

血脑屏障 (BBB) 是哺乳动物的一种特殊结构，通过调节血液和血液之间离子、氧气和营养物质的流入和流出，将大脑与血液分开，并维持zhongshu神经系统 (CNS) 的稳态。该屏障主要由脑微血管内皮细胞 (BMEC)、星形胶质细胞和周细胞组成。

转化生长因子β1 (TGFβ1) 是转化生长因子β (TGFβ) 家族成员之一，是一种多效性细胞因子，在多种病理和生理过程中发挥重要作用。

Hedgehog信号通路是重要的信号传导通路，在多个物种中是保守的，并且在生理和病理过程的许多方面发挥着重要作用。典型Hedgehog信号由三种分泌配体Shh、Ihh和Dhh激活，细胞间信号由转录因子Gli1、Gli2和Gli3转导。在zhongshu神经系统中，Hedgehog信号通路决定了神经管的形成和发育。

目前，已有研究表明Hedgehog信号与TGFβ1级联反应在癌症发展和转移中的相互作用。那么Hedgehog信号和TGFβ1级联反应之间的串扰是否会影响血脑屏障的功能呢，目前还尚不清晰。

华中农业大学兽医学院农业微生物学国家重点实验室和湖北省预防兽医学重点实验室联合在Brain Sciences杂志上发表了一篇名为《Astrocyte-Derived TGFβ1 Facilitates Blood–Brain Barrier Function via Non-Canonical Hedgehog Signaling in Brain Microvascular Endothelial Cells》，该文阐明了TGFβ1 介导的星形胶质细胞和大脑内皮细胞之间的细胞间交流，这一发现将拓宽关于血脑屏障内稳态的现有知识，也可能有助于进一步改善血脑屏障功能障碍的治疗策略。

作者通过构建人脑微血管内皮细胞 (hBMECs) 与U251的单培养和共培养模型，证实了星形胶质细胞衍生的TGFβ1增强了BMECs的屏障功能。实时荧光定量PCR、免疫印迹和酶联免疫吸附试验等多种实验表明TGFβ1在BMECs中触发Smad2/3的激活增加了Gli2的表达，Gli2是Hedgehog信号转导的关键转录因子。Gli2与ZO-1启动子结合，增强ZO-1的表达，从而维持血脑屏障。星形胶质细胞来源的TGFβ1触发BMECs中的TGFβ1-TGFBRII-Smad2/3-Gli1/2-ZO-1轴并维持正常的BBB功能。

文中作者通过免疫荧光技术，利用Echo Revolve正倒置一体显微镜进行免疫荧光观察。使用50ng/mL的重组TGFβ1 (rTGFβ1) 来刺激单层hBMECs，BMECs用绿色CD31标记，结果表明与对照组相比，ZO-1表达显著增加。

用4mg/kg的TGFβ/Smads信号抑制剂SD208处理小鼠，图中虚线环表示BMECs中的Gli1或Gli2的表达量，结果表明与对照组相比，ZO-1、 Gli1和Gli2表达量均减少。

内皮屏障功能方面发挥重要作用，提高了对血脑屏障功能的研究。这一发现也可能表明未来有可能使用TGFβ1和Hedgehog信号级联来辅助治疗血脑屏障功能障碍。

参考文献：

Fu J, Li L, Huo D, et al. Astrocyte-Derived TGFβ1 Facilitates Blood-Brain Barrier Function via Non-Canonical Hedgehog Signaling in Brain Microvascular Endothelial Cells. Brain Sci. 2021;11(1):77. Published 2021 Jan 8. doi:10.3390/brainsci11010077

课程大纲与简介

1.原子吸收分光光度计基本原理和结构

2.火焰法中常见的问题与解决方案

3.石墨炉法中常见的问题与解决方案

课程亮点

1.出现进样问题时，如何进行问题排除和解决？

2.出现低灵敏度、线性差，重现性和回收率不良等问题时应采取哪些措施？

直播时间：3月17日  15:00-16:00

培训费用：免费

听课方式：日立微学院（提交表单后扫码进群）

为了给您带来更优质的服务，感谢您抽出1分钟填写表单完善需求。

表单地址：https://jinshuju.net/f/h2e7Gt

在之前发表的文章《实时荧光定量PCR检测方法，你选对了吗?》中提到，实时荧光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探针法、分子信标、荧光共振能量传递(FRET)和LUX Primers等。那么应用最为广泛的则是SYBR Green染料法和TaqMan探针法，两者各有所长。今天，先给大家介绍TaqMan探针法，它优秀在哪里？

TaqMan 探针法

最关键的Taqman探针，是一条与靶序列特异性结合的寡核苷酸序列，其能够结合到正反向引物结合区域的中间部位，随着PCR反应的进行，DNA聚合酶在延伸到探针位置时会将其水解，从而释放荧光基团，扩增产物产生信号。

TaqMan探针法的优势

☑  高特异性，只有在探针和靶标基因之间发生特异性的水解，才会生成荧光信号。

☑  多重分析，可选择不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测多个不同的序列。

☑  无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

探针序列的设计原则

1. TaqMan探针的长度zuihao不超过30bp。理想情况下，有15bp可获得ZJ特异性；

2. Tm值在67℃-72℃之间，确保探针的Tm值比引物的高5-10℃，在退火过程中优先结合到模板上；

3. 探针序列的GC含量在20％至80％之间，避免多个重复的碱基出现，尤其要避免4个或超过4个的G碱基；

4. 探针尽量避免出现二聚体或者发夹结构，以保证足够高的模板结合效率；

5. 探针5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

引物探针设计不再犯愁

深蓝云生物为您提供Gene-π网站在线设计引物探针，可为您快速设计引物探针并进行评估，复制链接可进行查询：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

如何选择荧光基团和淬灭基团

修饰基团的选择是探针法的重要环节，那么我们需要注意以下几项：

1. 根据荧光定量PCR仪荧光通道，选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA，自身会发出荧光信号，干扰检测结果，后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 进行多重qPCR检测时，每个通道要选择不同的荧光基团，且避免各标记基团的激发和发射波长重叠，出现荧光干扰的情况。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。

除此之外，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，可为您的科学研究就提供高jingzhun、高灵敏可靠结果。

☑   数据可靠性

连续1000次实验后，结果高度一致，温控jingzhun，性能稳定可靠。

☑  应用灵活性

提供多种qPCR应用分析，定制化报告。

☑   流程智能化

中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

☑   交互灵活性

主机可独立运行qPCR程序，电脑、Wi-Fi、网络交互。

做Western Blot的小伙伴，是不是还在为选择何种归一化方法而纠结，看家蛋白还是总蛋白？期刊都推荐总蛋白了，那看家蛋白数据还能用吗？看家蛋白有哪些优点和挑战，需要注意什么？如何选择看家蛋白呢？如选择总蛋白归一化，用什么总蛋白试剂进行归一化，如何进行归一化，优点和挑战是什么？

本周邀请Azure Biosystems产品应用专家刘楚珠给正在迷茫中的小伙伴解惑。

直 播 课

同学们又是做qPCR实验的一天，有没有怀着忐忑又期待的心情去点开“analysis”的呢？点开之后，发现扩增曲线不正常，或者Cq值过大，又或者SD值太高，那这样的实验结果还靠谱吗？现在让小编来告诉你，qPCR实验的成功与否，关键在于各组数据是否达到判定标准以及是否符合实验预期，小小的qPCR实验它可以变得很简单，也可以变得很复杂，如何抓住qPCR数据分析的关键，是分析qPCR结果可信度的diyi步。

qPCR数据分析的关键

qPCR数据分析主要是利用Cq值进行计算，所以我们需要了解qPCR反应中几个重要的参数，根据参数的表现来进行实验评估：

扩增曲线：图1反映的是荧光信号变化量的对数与qPCR反应循环数的关系。图2反映的是随着qPCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短。标准的扩增曲线是呈现出“S”型，具有特征性的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

图1：扩增曲线对数图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

图2：扩增曲线线性图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

基线：通常3-15个循环时，荧光信号变化不大，变化趋势接近于一条直线，即扩增曲线的水平部分，这样的直线就是基线。同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。

阈值：是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线，自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置是置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Cq值：qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时一般取Cq:15-35，太大或者太小都会导致定量的不准确。

图3：扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

评估qPCR反应的效果

1、扩增效率及相关系数

为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。扩增效率E在90-110%之间时，认为扩增接近理想情况。

R²值：评估PCR效率的另一个关键参数，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R²等于1，则可以用Y值（Cq）来准确预测X值（初始模板量）。反之，如果R²等于0，就不能通过Y值来预测X值。一般认为，标准曲线的R²值大于0.98时，两个数值之间相关的可信度很好。

图4：标准曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

2、重复性

重复性即是指精确度，反映多次测量值之间的接近程度。标准偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。例如，假设PCR反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Cq间隔应该恰为1个Cq值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。总的来说，重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

图5：8个重复孔的扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

3、重现性

指不同批次之间或不同实验室之间qPCR结果的变化，通常表示为拷贝数或Cq值的SD或CV。

图6：4台独立的Azure Cielo 仪器上检测GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、灵敏度

分析灵敏度是指一个样本中可通过实验精确测量的最小拷贝数，而临床灵敏度是指在特定疾病患者们中，被检测确定为阳性的百分比。灵敏度为limit of detection（LOD），即在给定的分析程序中，可以确定且合理（通常使用95%的概率）检测得到的浓度，可通过梯度稀释样品来确定ZD检测限。LOD理论上最小是3 copy/aliquot，这是由遵从泊松分布的取样误差导致的。假设符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和检测到1个拷贝。

图7：5个数量级的动态范围检测。图源：Azure Cielo qPCR系统。

5、准确度

反映测量值和真实值的接近程度，以倍数变化或拷贝数进行估算。

6、特异性

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

图8：溶解曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

来自美国Azure Biosystems公司的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为您提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。该系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，可为您的科学研究就提供高jingzhun、高灵敏可靠结果。

Azure  Cielo™性能展示

☑   高重现性和稳定性

连续1000次实验后，结果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

☑  高重复性

重复孔的扩增曲线高度重合

96孔重复结果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

变异系数（Cv）=0.002。

☑   高分辨率

准确区分2倍浓度差异样品

人内参cDNA（GAPDH）进行10个梯度，

2倍稀释，3个重复，线性拟合度

R²=0.998，扩增效率E=99.89%