做标准曲线一定要等比梯度稀释吗

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  baioshud 2017-08-20 00:00:00

  CCK8操作说明 细胞活性检测 1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。 2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。 3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。 细胞增殖 -毒性检测 1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。 2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。 3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6，12， 24 或48小时 )。 4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。 5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉物的影响。当然物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入物后的空白吸收即可。 制作标准曲线 1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)。 同仁CCK8检测步骤 CCK-8 检测步骤 1. 向各孔中加入100 μl细胞悬液。a) 2. 在37℃下预孵育培养板。b) 3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl。 4. 37℃下孵育。 5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。 6. 37℃下孵育1-4小时。e) 7. 测定450 nm处的OD值。 a) 使用适当的培养基制备50，000-100，000个/ml的细胞悬液。 b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。 c) 使用培养基或PBS来制备溶液。 d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl CCK-8进行检测。 e) 白细胞可能需要培养较长时间。 活力计算 细胞活力*（％）=[A(加)-A（空白）]/[A（0加）-A（空白）] ×100 A（加）：具有细胞、CCK-8溶液和物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加）：具有细胞、CCK-8溶液而没有物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 DOJINDO CCK8 初学者问答 (同仁DOJINDO)

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