乳糖和半乳糖有什么区别？

导论
乳糖操纵子（lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因， 负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调节是分子生物学中一个被充分研究的系统。而乳糖阻遏物这一个DNA 结合蛋白（lacI）是控制乳糖操纵子的关键。 该系统的平衡解离常数（KD）通常估计在 nM 范围内。 

这种 lacO / lacI 系统通常在本科基因调控的生物化学和生物学课程中引入。更高级关于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色质编辑中的应用。 

在更广泛的领域里，SPR 对蛋白质-DNA 复合物研究在理解基因表达调节途径中有相当重要的地位。
在这篇应用笔记我们将分享蒙特利尔大学学术实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力，KD）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR 测定，以便于在本科实验课程中演示该生物系统。

图1 乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白组合

实验装置

系统设置

图2 台式P4SPR设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作控制和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。 首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。 S 形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供一式三份的样品测量以及与参考通道的一次控制测量。 通过透明通道可以在直接观察在通道中是否有形成的气 泡，以便立即清除而防止任何信号丢失。

图3 P4SPR微流体单元

实验步骤

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。 固定化自发地造成强金-硫键形成，直到 SPR 表面饱和后产生平台信号。 然后注射互补的 LacO 寡聚体以允许杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。 通过先前储备的液蛋白溶液来制备 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每种逐渐增加浓度的溶液， 并用其中的大量洗涤溶液和再生缓冲液孵育 10 分钟，以从先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有4 个通道的数据，然后导出到 Excel 进行进一步的数据分析。
 
结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。 对该信号进行平均后从参考信道信号中减去来取得 SPR 信号相对于时间绘制（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 KD（图 6）。
计算的 KD 为 6.4±1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录YZ蛋白的文献报道值1。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测结合相互作用。

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式，便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR 工具。 它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量和结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地展出乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可从之前发表的文献验证。 本科生可从该实验熟悉该 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。 此外，P4SPR 系统也可考察其他生物系统，如 DNA-DNA，RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合并揭示生物通路中的功能。
 
致谢
我们要感谢 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 SébastienTruche 开发该化验。
 
关于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité Instruments 的创始人在 SPR 领域积累了十多年丰富的研究结果的知识，并通过多元化的商业，科学和工程领域经验将创新的 SPR 技术商业化。

参考文献
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

近些年来随着健康意识的提高，人们对于食品添加剂和膳食补充剂的兴趣不断增加，如低聚半乳糖等益生元开始引起人们的关注。

食品和食品补充剂中低聚半乳糖的含量必须满足安全和相关法规的要求，如 GB 14880-2012 《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》中规定婴幼儿谷类辅助食品和婴幼儿配方食品中低聚半乳糖（乳糖来源）、低聚半乳糖（乳清滤出液来源）含量不得超过64.5g/kg。目前对于低聚半乳糖的检测，应用最广泛的是通过酶水解将其分解为小分子糖，然后进入色谱分析。

目前国内低聚半乳糖的标准检测方法尚未正式发布，因此本文以 AOAC 2001.02 方法为蓝本进行描述并改进。使用配有安培检测器的瑞士万通离子色谱（IC-PAD）可对低聚半乳糖进行全自动分析。

什么是低聚半乳糖?

低聚半乳糖为在葡萄糖或半乳糖分子上链接1~7个半乳糖基的碳水化合物，是食品和饮料中少量天然存在的益生元。低聚半乳糖最初在人类母乳中发现，是母乳中的主要成分，其含量高达12g/L，因此被添加到婴幼儿奶粉中作为益生元补充剂。低聚半乳糖可以在肠道中表现出双岐化作用，调节肠道菌群，支持非致病细菌的生长。

食品标签对低聚半乳糖的要求

全 球益生元和低聚半乳糖市场的增长来自于消费者健康意识的提升，为回应这种意识提升，EU 1169/2011 和 EU 2015/2283 以及 GB 14880-2012 都对其含量做出了规定。因此我们必须对食品和营养补充剂中的低聚半乳糖进行测定。

低聚半乳糖对人体健康影响的研究表明，每人每天摄入的低聚半乳糖建议不超过30g，婴幼儿配方奶粉则需要执行更加严格的规定。

AOAC 2001.02

目前测量食品中低聚半乳糖最常用的方法就是 AOAC 标准方法 2001.02，国内相关标准的征求意见稿也是以此为参考。该方法是将低聚半乳糖从食品中提取出来之后将其水解为单糖，然后使用带有安培检测器的阴离子交换色谱进行分析。

AOAC 2001.02 方法是将提取液与用β-半乳糖苷酶处理的水解液进行比较。在β-半乳糖苷酶催化下，糖苷键断裂，低聚半乳糖和乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。两种溶液中测定的游离半乳糖和乳糖的浓度差即可用来计算低聚半乳糖含量（图1）。

图1. 根据 AOAC 2001.02 方法测定低聚半乳糖含量的示意图，以及瑞士万通优化后的方法(绿色)。

对AOAC方法的改进

AOAC 2001.02 的样品制备过程相当复杂：一方面是对照提取液需要加入昂贵的失活酶以维持提取液中各种糖浓度不变（图 1）；另一方面，样品是使用乙腈溶液稀释，而标准品则是用超纯水制备。

本文中我们将简化整个过程以提高方法的易用性和分析效率。

实验证明，在提取溶液中添加失活酶与否并不会影响提取物中葡萄糖、半乳糖和乳糖浓度，因此我们取消了该步骤，节省了大量的费用和手工劳动。总低聚半乳糖含量的测定，仅需测量不含任何酶的提取液和添加了活性酶的水解液即可完成。

图2. 某品牌益生元补充剂未处理(黑色)和酶处理(橙色)的叠加色谱图。

应用报告

“如果想要了解更多分析细节

您可以识别左侧二维码

下载相关应用报告AN-P-087

除了酶的使用，AOAC 方法还建议在超纯水 (UPW) 中制备标准品，而用 20% 乙腈稀释实际样品。我们按照以下条件做了对比试验：

◆ 使用纯水做校准曲线，纯水稀释样品（纯水）

◆ 使用纯水做校准曲线，乙腈稀释样品（AOAC方法）

◆ 使用乙腈做校准曲线，乙腈稀释样品（乙腈）

在以上三个条件中，低聚半乳糖含量的重现性在纯水和 AOAC 方法之间表现类似，而乙腈方法中低聚半乳糖含量低于其它方法，乙腈似乎对样品并不具有稳定作用。因此我们可以使用纯水对样品进行稀释来改进 AOAC 方法，减少化学试剂的使用。

结果

总体而言，改进后的方法在分离度、回收率以及特异性方面表现出很好的稳定性，半乳糖检出限为 0.1mg/L，葡萄糖和乳糖为 0.2mg/L，可以满足低浓度样品的测量需求。

总结

在糖类分析方面带有安培检测器的离子色谱法是一种灵敏、稳定且选择性非常好的多组分分析方法，而且无需任何额外的衍生步骤。结合酶处理，离子色谱可以对非常复杂的糖类进行分析。

本研究对食品中低聚半乳糖测定的 AOAC 方法进行了优化，虽然原理相同，但是分析效率得到大幅提升，可以大大降低实验室时间和运行成本。如使用其它自动化样品处理技术，如英蓝逻辑稀释技术和英蓝自动校准技术，还可进一步提升工作效率。

导论
乳糖操纵子（lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因， 负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调节是分子生物学中一个被充分研究的系统。而乳糖阻遏物这一个DNA 结合蛋白（lacI）是控制乳糖操纵子的关键。 该系统的平衡解离常数（KD）通常估计在 nM 范围内。这种 lacO / lacI 系统通常在本科基因调控的生物化学和生物学课程中引入。更高级关于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色质编辑中的应用。 

在更广泛的领域里，SPR 对蛋白质-DNA 复合物研究在理解基因表达调节途径中有相当重要的地位。
在这篇应用笔记我们将分享蒙特利尔大学学术实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力，KD）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR 测定，以便于在本科实验课程中演示该生物系统。

图1 乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白组合

实验装置

系统设置

图2 台式P4SPR设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作控制和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。 首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。 S 形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供一式三份的样品测量以及与参考通道的一次控制测量。 通过透明通道可以在直接观察在通道中是否有形成的气 泡，以便立即清除而防止任何信号丢失。

图3 P4SPR微流体单元

实验步骤

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。 固定化自发地造成强金-硫键形成，直到 SPR 表面饱和后产生平台信号。 然后注射互补的 LacO 寡聚体以允许杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。 通过先前储备的液蛋白溶液来制备 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每种逐渐增加浓度的溶液， 并用其中的大量洗涤溶液和再生缓冲液孵育 10 分钟，以从先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有4 个通道的数据，然后导出到 Excel 进行进一步的数据分析。
 
结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。 对该信号进行平均后从参考信道信号中减去来取得 SPR 信号相对于时间绘制（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 KD（图 6）。
计算的 KD 为 6.4±1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录YZ蛋白的文献报道值1。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测结合相互作用。

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式，便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR 工具。 它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量和结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地展出乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可从之前发表的文献验证。 本科生可从该实验熟悉该 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。 此外，P4SPR 系统也可考察其他生物系统，如 DNA-DNA，RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合并揭示生物通路中的功能。
 
致谢
我们要感谢 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 SébastienTruche 开发该化验。
 

参考文献
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893