led荧光显微镜法观察结核分枝杆菌用什么荧光滤块

一、荧光基础知识

在显微成像中，荧光指的是一种光致发光现象，某些分子能吸收特定波长的光线，然后再发射出其他波长的光线的物理现象，这种分子一般称为荧光团。通常情况下，由于斯托克斯位移，荧光团的激发峰值和发射光谱之间存在差值，发射光线能量低于吸收光线，波长比激发光更长。

荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光也称固有荧光，是指经照射后就能发出荧光；继发荧光也称二次荧光，物质经照射后不能或只能部分发生微弱荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。目前在荧光显微技术中，主要利用的是继发荧光现象。

念珠藻叶绿体的自发荧光，明美MF52-N拍摄

荧光产生包含激发和发射两个过程，在荧光显微技术中具体体现为以下几个关键部件：

（1）激发光源：主要包含以下两个指标

Ø 光源光谱覆盖发射光谱：荧光团在特定波段范围才能被大部分激发，因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光团激发特征。

Ø 发射光谱波段的强度：荧光信号一般较弱，需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。

（明美-四通道LED光源MG120，宽光谱 + 高光功）

（2）激发块：用于形成特异性激发/发射的一组滤光片，一般包含以下三个

Ø 激发滤光片EX：滤过光源中特定波段的光，用以激发样本中特定染料

Ø 发射滤光片EM：允许荧光团发射的特定波段的光通过

Ø 二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。透射荧光显微镜没有这个滤光片，但目前主流都是落射荧光显微镜，会有二向分光镜。

（明美可定制适配四家品牌，不同波段需求的激发块）

二、荧光显微成像的应用

荧光显微镜利用自发荧光或继发荧光现象，广泛用于生物（医学）、矿物、材料科学等领域的显微荧光观测。①在生物学领域，主要借助荧光染料标记，可准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。②在矿物学领域，通常用于研究有自发荧光特性的物质，如石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。③在材料科学，可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张，在半导体领域，也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED荧光显微镜观察SBS改性沥青

（MF43-N拍摄的磁珠荧光图片）

荧光显微技术在生物学领域中应用是广泛也是复杂的，主要是对细菌、细胞、组织或小型生物（如斑马鱼等模式生物）进行标记成像，它的微观层面都是通过荧光染料对分子层面进行标记。从荧光染料的选择看，通常需要考虑几个因素，一是荧光染料标记的位置，二是该染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖进行染色，甚至钙离子等非生物物质也可以检测。以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：

FITC荧光染色，MF52-N拍摄

（1）免疫荧光（IF）：主要标记的是蛋白质。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。

Ø FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，495/517 nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。

Ø TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，550/573 nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。

Ø 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光量子产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。

Ø Alexa Fluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。

DAPI荧光染色，MF52-N拍摄

（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置。

Ø DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在358nm处有一个吸收峰值，在461nm处有一个发射峰值，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。

Ø Hoechst（33258、33342、34580）：这三种染料都可在350nm左右的紫外光激发，在461nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。

Ø PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，激发波长为538 nm，发射波长为617 nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。

Fura2钙离子探针做的研究图片， 引自公开文献
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）离子成像：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。

三、荧光显微成像的挑战

应用荧光显微技术进行成像的过程中，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微技术应用中的常见挑战与应对方法：

汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用

（1）激发光源选择和使用。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，寿命较短可能就200小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，替换灯泡后需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-100，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。

明美可定制适配四家品牌的滤光片组

（2）滤光片质量和匹配度。激发块中的滤光片质量会影响激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，明美建议使用数显荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四家品牌显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光需求，明美提供匹配四家品牌主流荧光显微镜的激发盒和滤光片组，可按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。

（MF43-N+MC50-S拍摄的小鼠脑片荧光图像）

（3）光毒性与荧光染料毒性：在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用具有较低能量（波长较长）激发光谱的荧光染料；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，需要在成像质量与样本健康之间保持平衡；③降低帧速率，尤其在长时间的荧光成像中，这种情况需要提高相机的灵敏度，保证捕获微弱的荧光信号。

（单通道荧光拍摄，经软件合成多色荧光图像）

（4）多色荧光成像：在生物学领域应用较多，尤其是在对活细胞标记成像时，需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，而大多数荧光染料具有宽发射光谱，在使用多种染料标记时会出现荧光光谱重叠现象。对于多色荧光成像，有两种应对思路，一是针对每种染料使用对应的单通道窄带滤光片，后通过软件进行合成，这种方式对成像速度及软件图像处理提出较高要求；二是使用宽光谱光源同时激发，选用双通滤光片或多通滤光片，这种滤光片的的特点是允许两种或以上波段荧光信号通过，可实现一组滤光片同时观察两种或以上荧光染料，这种方式要求相邻的发射光谱范围没有重叠，所得到的荧光信号之间能较好的被区分。

（双通滤光片荧光拍摄，镜下可同时观察到B\G两种荧光信号）

来源：https://www.mshot.com/article/1527.html

明美倒置LED荧光模块助力升级荧光显微镜

显微镜LED荧光模块助力升级荧光显微镜（无需重置荧光显微镜），作为荧光显微镜的重要附件，通过大功率的照明装置发出较短波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光，经过物镜作用在样品上，再通过显微镜观察荧光物体的形状及其所在位置，从而对这类物质进行定性和定量的研究。

明美倒置荧光模块为三色四通道结构设计，标配三个大视野荧光通道与一个明场通道。波段切换稳定顺畅。用户可根据需求，自由选择荧光波段、数量。采用LED冷光源，基于外形精简、操作简便的设计理念，将驱动电源、LED激发光源及荧光滤光组一体化（可适配不同品牌倒置显微镜，如图中搭配奥林巴斯倒置显微镜CKX41）

 有了显微镜LED荧光模块的出现，逐渐替代高压汞灯、金属卤素灯、氙灯等光源，显微镜LED荧光模块采用大功率LED作为照明光源，具有光效率高，发热小，寿命长等优点，稳定性高，为较长时间的连续实验提供荧光照明，参数可视化、操作简单、视野升级，兼容性更好，推动荧光显微镜在科研领域中使用的普及率。

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来源：https://www.mshot.com/article/1576.html

     荧光显微镜是由生物显微镜和落射荧光装置组成，有消杂散光系统，可以将强烈的杂光导入至物镜光路之外，并加以吸收，提高了显微镜的图像信噪比。

     下面是荧光显微镜的灯泡的调中和荧光观察的方法:

     一、灯泡调中的方法：

    （1）任选一块标本放在载物台上；

    （2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光(V)或蓝光(B)或绿光(G)激发滤色片组转入光路，并将10X荧光物镜转入光路；

    （3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰；

    （4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至较大；

    （5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰；

    （6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中；

    （7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开；

    （8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。

    二、如何进行荧光观察：

    （1）将荧光染色标本放到载物台上。

    （2）将10X平场物镜或40X荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。

    （3）转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长<双色束分离器的透射波长<阻断滤光片的透射波长。由于激发滤光片、双色束分离器和阻断滤光片，出厂时已按其用途和本身的光学特性进行了严格的组合匹配，在观察和摄影时，只需选择滤光片组即可。

    （4）调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。

    （5）当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。

    （6）当需要使用40X或100X荧光物镜观察时，应在标本和物镜间加上甘油，油中不能有影响观察的小泡或杂质。使用时可使甘油慢慢浸润一会儿，然后轻轻左右来回转动物镜转换器以排除气泡。

    荧光显微镜对于物质的检出能力是非常高的，具有放大的作用；而且对于被检测物质的细胞的刺激也是非常小的，可以检测活体的染色体；还有就是可以进行多个步骤的染色。对于荧光素的构造观察是非常好的，一般的显微镜是看不出来的。而且对于一些物质是否有荧光，荧光是什么色调的进行判断，还能看出是不是抗体的荧光。此款显微镜对于物体的定性、定量分析都是可以测定的。

明美倒置荧光显微镜助力山东农大食品学院荧光活细胞观察

细胞培养已经在越来越多领域的研究中成为基础技术，而为了进行进一步的研究，往往需要使用荧光标记技术，如近期，山东农大食品学院需要一套倒置荧光显微镜供研究生研究使用，用于荧光活细胞观察。

活细胞成像有较多注意事项，如将活细胞暴露于光线下会导致光毒性和样本生理机能变化，因此获得的结果可能与健康生物体的实际情况不符。 如果需要观察荧光转染细胞，宽场荧光显微镜通常是活细胞成像的好选择。明美倒置荧光显微镜MF53-N选用触屏控制LED冷光源，UV紫外波段单独控制，光毒性更低。

倒置荧光显微镜MF53-N可扩展性强，标配转盘式六孔荧光模块，可自主选择需要的荧光波段，还能扩展三轴高精度电动平台和TIRF全内反射观察，实现更高的Z轴分辨率和更清晰锐利的荧光成像。

您若对倒置荧光显微镜MF53-N感兴趣或存在疑问，欢迎与我们联系

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来源：https://www.mshot.com/article/1777.html

荧光显微镜怎么调荧光：专业指南

荧光显微镜作为现代生物学、医学研究和材料科学中不可或缺的工具，广泛应用于观察细胞结构、分子定位以及各类荧光标记物的追踪。如何调节荧光显微镜中的荧光信号，以获得清晰且高对比度的图像，常常是初学者和有经验的使用者都会遇到的挑战。本文将详细介绍荧光显微镜的荧光调节方法，包括如何选择合适的滤光片、设置激发光源、优化荧光强度等方面，帮助用户提升实验效果和图像质量。

荧光显微镜的基本构成

在调节荧光显微镜的荧光效果之前，了解其基本构成至关重要。荧光显微镜主要由光源、滤光片系统、样品载物台、反射镜和相机等部分组成。光源提供激发光，而滤光片系统则用来过滤特定波长的光线，使得激发光照射到样品上，进而激发样品发出荧光。为了优化荧光图像的质量，正确调节每一个组成部分都是必要的。

选择合适的激发光源

激发光源是荧光显微镜的核心之一，合适的激发波长能够大化样品的荧光信号。常见的激发光源包括氙灯、汞灯和LED灯等。选择激发源时，首先要根据荧光染料的激发波长范围来选定。不同的荧光染料对不同波长的激发光有佳响应，因此确保激发源的波长与样品的激发要求相匹配，是调节荧光显微镜的步。

设置合适的滤光片系统

滤光片系统在荧光显微镜中起着至关重要的作用。滤光片通常分为激发滤光片、放射滤光片和透射滤光片，分别用于选择性地控制激发光的通过、分离样品发出的荧光以及去除杂散光。在选择滤光片时，应根据染料的吸收和发射波长来确定合适的激发和发射滤光片。例如，对于绿色荧光蛋白(GFP)，选择与其激发波长(488 nm)和发射波长(510 nm)相匹配的滤光片是十分必要的。

优化荧光强度

在调整荧光显微镜时，荧光强度是影响图像质量的另一个关键因素。过低的荧光强度会导致图像对比度不清晰，而过高的强度则可能导致信号饱和。通过调整激发光源的强度、曝光时间以及光学增益，可以获得合适的荧光强度。样品的浓度、染料的质量以及荧光标记物的稳定性也会对荧光强度产生影响，因此在实验过程中应时刻注意这些变量。

调整焦距和图像对比度

调整焦距是确保荧光图像清晰的必要步骤。使用荧光显微镜时，焦距的精确调整能帮助获得清晰的图像。适当的图像对比度调整有助于突出荧光信号，减少背景噪音。通过微调曝光时间和亮度，也可以增强对比度，使得样品的荧光信号更加鲜明。

总结

调节荧光显微镜的荧光效果是一个精细且复杂的过程，涉及到多个因素的协调。选择合适的激发光源、滤光片系统的优化、荧光强度的调整以及图像的焦距与对比度设置，都是确保高质量荧光图像的重要步骤。通过深入理解并熟练掌握这些调节技巧，可以显著提升实验的效果和图像的清晰度。希望本文能为使用荧光显微镜的科研人员提供有价值的指导，帮助大家在荧光成像中获得佳的实验结果。

活细胞通常用倒置荧光显微镜看起来方便，细胞在下面，离物镜近，还可以用油镜，成像质量要比正置好，分辨率高。老师需要对活细胞的生长状况以及荧光需要观察清楚，同时使用上希望比较方便。

解决方案：

明美工程师给客户推荐高性价比的倒置荧光显微镜MF52-N,可更方便的通过多种方法观察样品，同时操作简单、方便，减少工作中的疲劳，也无需担心调焦过度而损坏物镜，另外根据客户要求搭配进口带通滤色片，荧光效果好。同时推荐了高像素相机MSX2，这款显微镜相机像素达到了1250万，能够使显微成像效果更加清晰，细节展示更加丰富，满足客户的要求。

（来源：http://www.mshot.com/kehuanli/20200410.html）