讲座通知|单细胞显微操作系统FluidFM BOT在单细胞分离中的应用

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多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT简介

       北京大学生命科学学院公共仪器ZX引进的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是国内首套系统。于2020年9月顺利安装于金光楼126室并开始运行，生科院公共仪器ZX覃思颖老师直接负责仪器的管理维护和样本测试工作。

       FluidFM BOT是一种将微量注射与原子力显微镜技术相结合的新一代单细胞显微操作系统。它所整合的纳米级位移台能够实现在细胞表面进行JZ的操作和fL级的流体控制。因此FluidFM BOT在技术层面上具有非常ZY的单细胞操纵能力。

多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT独特秘籍

        在当代生物学与医学的研究中，对单个细胞的分离一直有着很高的需求。然而传统手段中却鲜有能够在原位无损的细胞分离的操作设备和技术。而FluidFM在这一方有着独特的秘籍，它能够在原位仅消化单个细胞并将其转移到指定位置。

使用FluidFM BOT进行单细胞分离：

• 通过fL压力泵实现单个细胞的胰酶消化

• 将单个细胞通过强大的微管探针直接抓取并放置在指定部位

• GX而简便化自动操作

多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT应用实例

       瑞士Cytosurge AG公司的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统合为一体的单细胞操作系统，采用不同孔径的微型纳米注射器，可实现单细胞注射（Injection）、活细胞内物质提取（Extraction）、单细胞分离（Isolation）、粘附力测定（Adhesion）、纳米打印(Nano-printing)等多种功能，全程机械臂操纵，将污染风险和人为误差降到ZD，提高工作效率与实验可重复性，具有高度自动化、操作速度快与操作精确度高等特点，能够在单细胞水平上为研究者提供极大的便利，可应用于单细胞质谱、单细胞力谱、单细胞基因编辑、细胞系构建、药物研发、JZYL等领域。

       北京大学生命科学学院公共仪器ZX的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是国内首套多功能单细胞显微操作系统，于2020年9月顺利安装于金光楼126室并开始试运行，由公共仪器ZX覃思颖老师负责接样测试与维护管理。目前本ZX的FluidFM BOT系统已成功应用于单细胞注射与物质提取（小鼠体外培养原代海马神经元、昆虫叶蝉细胞、MDA-MB-231细胞等）、单细胞分离（植物细胞原生质体、U2OS细胞等）与粘附力测定（细菌侵染细胞时细菌的粘附力、血管内皮细胞对不同基底的粘附力等）等多方面科研需求。

以下是多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT的多个功能应用与实例介绍。

FluidFM BOT结合原子力系统、微流控系统于一体

（https://doi.org/10.1021/nl901384x）

FluidFM BOT功能应用

单细胞注射实例
 

       FluidFM BOT可以将多种不同类型的可溶性物质JZ注入细胞核或细胞质中，可量化注射体积（fL级别），可实现批量注射（每小时注射超过100个细胞），尤其适用于使用传统方法极难转染的细胞，且对细胞几乎没有损伤。

CHO细胞的Lucifier Yellow染料注射

C57小鼠体外培养原代海马神经元DIV7的Dextran染料注射（北大生科院数据）

活细胞内物质提取实例
 

       FluidFM BOT系统的活细胞内物质提取功能十分温和，可直接用微型纳米注射器吸取活细胞的细胞质或细胞核中的物质，无需经过化学或生物学手段进行破膜处理，不会产生裂解的细胞碎片，不会对内部细胞器造成任何破坏，可用于电镜成像、酶活检测、核酸表达检测、代谢组学、基因测序等多方面研究。

活细胞提取物可结合电镜观察、酶活测定、转录检测等分析手段

（http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.025）
 

HeLa细胞的细胞质物质提取

单细胞分离实例
 

       FluidFM BOT可进行无损细胞分离，对于悬浮细胞，可将细胞吸取并转移释放即可。对于贴壁细胞，可在探针的样品池中加入消化液如胰酶，对指定位置的细胞进行消化，然后再进行吸取与转移释放。FluidFM BOT实现的单细胞分离存活率很高，结合单细胞注射可实现快速转染细胞并建立单克隆细胞群，对于工程细胞株的建立十分有效。

植物原生质体的单细胞分离

（北大生科院数据）
 

贴壁细胞CHO的单细胞分离

粘附力测定实例
 

       FluidFM BOT系统通过负压将细胞吸附在探针针孔处，对细胞的吸附力比蛋白结合更加牢固，能够直接将细胞从基底上分离。这种方法不需要激活细胞的任何信号通路，可以得到最接近细胞原生的数据。不同的探针针孔直径（2、4、8um）可适用于不同大小的细胞粘附力测定，我们甚至可使用孔径为300nm的探针进行更小个体的吸附与粘附力测定，目前在本ZX的FluidFM BOT系统已成功应用于金黄色葡萄球菌侵染大鼠肠上皮细胞时的细菌粘附力测定（nN级别）。
 

不同大小的单细胞粘附力测定

（https://doi.org/10.1038/s41598-019-56898-7）

纳米打印实例
 

       FluidFM BOT系统还是一台纳米打印设备，可以在实验器材上铺设特定的基底膜，如打印亲水或亲脂性物质，从而实现对细胞贴壁的操纵，构建不同的细胞模式，实现对细胞信号转导机制、肿瘤细胞群落迁徙、神经细胞树突或轴突形成的研究。

CMD基底打印cRGDfK的细胞贴壁生长Pattern研究

（DOI: 10.1021/acs.langmuir.8b03249）

       多功能单细胞显微操作系统在高性能单元的监控下，通过全自动的工作站实施操作，可确保实验的平稳、顺利的进行。探针有多种孔径规格可选，也可结合FIB技术进行探针定制，结合不同的探针可实现各式各样的应用，以上仅展现部分应用，更多的新功能有待各位老师与同学结合自己的课题需求进行探索与发掘，欢迎大家联系前来测试样品！

单程细胞具有复杂生物学性质，它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接，诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先，由于细胞与基质的作用力仅为nN级别，因此需要力学精度较高的设备才能够测量，而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜（AFM）。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制，需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起，这个过程十分繁琐，并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值，无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。

而多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状，它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞，取得和AFM近似精度的数据，无需在探针上进行任何修饰，不会改变细胞表面的任何通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞，具备很高的自动化，能够快速测量细胞粘附力。

使用FluidFM对细胞操作的基本流程

FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示，FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端，通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离，并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力，评估细胞群体分布以及细胞间差异，并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最佳测量时间导致的细胞粘附力改变，得到更为精准的结果。近期，Agoston等人使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM实现了高通量细胞粘附力测量，对同种细胞不同区以及不同细胞之间的粘附力进行测量和比较。

作者首先对Vero和Hela细胞在不同状态下的粘附力进行了测量和比较，总共测量了214个细胞。通过比较明胶涂层上处于单个细胞、孤岛状细胞、致密连接细胞以及单层细胞上游离细胞之间的粘附力，能够明显观测到Vero细胞处于致密连接的细胞粘附力最大，大概在750 nN左右，随着细胞单细胞层的稀疏，细胞粘附力有所下降，而处于细胞层顶部的细胞粘附力最低仅为50 nN左右。这一点充分说明上皮细胞能够在细胞之间形成紧密的连接，而处于细胞层外的细胞则几乎没有粘附力。而对于HeLa这样的肿瘤细胞测量的结果却显示出了截然不同的结果，处于不同状态的细胞有着近似的粘附力，基本都在200 nN左右，这与处于单个游离上皮细胞的粘附力十分接近，表明HeLa细胞在不同环境下仍然具有较高迁徙能力。

使用FluidFM对不同区域细胞的FD曲线测定结果和对比

       通过对这两种细胞的最大粘附力、最大粘附能量、最大拉伸距离和细胞接触面积进行统计分析可以发现，HeLa肿瘤细胞在粘附力和粘附能量上均有所降低，但是当HeLa细胞形成了单层后，两者区别不大。

对比Hela和Vero在不同生长状态下的最大粘附力、最大粘附能量、粘附拉伸距离和粘附面积。

再进一步对Vero与HeLa细胞最大粘附力与距离和接触面积进行对比，依然可以得到与单独比较粘附力相同的结果，并且最大能量与细胞接触面积的比值中也存在着类似的结果。由此可见肿瘤细胞通过降低自身粘附力从而获得了更好的迁移能力。

对不同状态Vero和A549之间的粘附力/粘附距离、粘附力/粘附面积、粘附能量/粘附面积

总结

       细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用，然而传统手段中有着各种各样的局限性，主要原因是缺乏一种有效抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM技术在细胞粘附力测定中的应用，使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞，配合原子力显微镜精确测量的特性，真正意义上做到精准、无损、快速的测量单细胞粘附力，帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。

【参考文献】

[1] A. Sancho, M. B. Taskin, L. Wistlich, P. Stahlhut, K. Wittmann, A. Rossi & J. Groll. Cell Adhesion Assessment Reveals a Higher Force per Contact Area on Fibrous Structures Compared to Flat Surfaces. ACS Biomater. Sci. Eng. 2022, 8, 2, 649–658.

[2] P.W. Doll, K. Doll, A. Winkel, R. Thelen, R. Ahrens, M. Stiesch & A.E. Guber. Influence of the Available Surface Area and Cell Elasticity on Bacterial Adhesion Forces on Highly Ordered Silicon Nanopillars. ACS Omega. 2022, 7, 21, 17620–17631.

[3] Sankaran, S. Jaatinen, L. Brinkmann, J. Zambelli, T. Vörös, J. Jonkheijm, P. Cell adhesion on dynamic supramolecular surfaces probed by fluid force microscopy-based single-cell force spectroscopy. ACS Nano 2017, 11, 3867–3874.

[4] Sancho, A. Vandersmissen, I. Craps, S. Luttun, A. Groll, J. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci. Rep. 2017, 7, 46152.

[5] Ines, Lüchtefeld. Alice, Bartolozzi. Julián M. M. Oana, Dobre. Michele, Basso. Tomaso, Zambelli. Massimo, Vassalli. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. J Nanobiotechnol. 2020, 18, 147.

[6] Dehullu, J. Valotteau, C. Herman-Bausier, P. Garcia-Sherman, M. Mittelviefhaus, M. Vorholt, J. A. Lipke, P. N. Dufrene, Y. F. Fluidic force microscopy demonstrates that homophilic adhesion by Candida albicans Als proteins is mediated by amyloid bonds between cells. Nano Lett. 2019, 19, 3846–3853.

[7] Mittelviefhaus, M. Müller, D. B. Zambelli, T. Vorholt, J. A. A modular atomic force microscopy approach reveals a large range of hydrophobic adhesion forces among bacterial members of the leaf microbiota. ISME J. 2019, 13, 1878–1882.

[8] F. Weigl, C. Blum, A. Sancho & J. Groll. Correlative Analysis of Intra- versus Extracellular Cell Detachment Events vis the Alignment of Optical Imaging and Detachment Force Quantification. Adv. Mater. Technol. 2022, 2200195.

【相关产品】

　　多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM:https://www.yiqi.com/zt2203/product_386418.html

研究现状

单程细胞具有复杂生物学性质，它们通过细胞外基质ECM形成紧密的细胞与基质细胞与细胞连接，诸如上皮细胞通过这种特殊的链接方式构成了屏障层保护人体免受外界损伤。因此细胞之间以及细胞基底的粘附力测定对于研究细胞粘附蛋白的机制有着重要意义。使用力学工具测量细胞间以及细胞与基质之间的粘附力始终不是一件容易的事情。首先，由于细胞与基质的作用力仅为nN级别，因此需要力学精度较高的设备才能够测量，而且在这其中较为适合的工具为原子力显微镜（AFM）。原子力显微镜能够提供纳米级别的操作精度并可测量从pN~nN范围的力谱。但是受制于AFM探针本身的限制，需要借助修饰手段才能够让细胞与探针固定到一起，这个过程十分繁琐，并且由于需要大量手工操作很难实现高通量的测量。而不同的细胞由于细胞异质性使得要想确定粘附力需要较多样本才能获得相对准确的值，无法实现高通量测量直接限制了原子力探针在细胞粘附力上的应用。

多功能单细胞显微操作FluidFM技术

多功能单细胞显微操作FluidFM技术的出现改变了这一现状，它使用特殊的中空探针能够轻松地通过负压抓取细胞，取得和AFM近似精度的数据，无需在探针上进行任何修饰，不会改变细胞表面的任何通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。在实验结束后能够通过正压快速丢弃用过的细胞，具备很高的自动化，能够快速测量细胞粘附力。

使用FluidFM对细胞操作的基本流程

FluidFM在粘附力测量上具备显著优势。如图所示，FluidFM能够通过负压将细胞吸附到原子力探针的末端，通过高精度位移台的控制将细胞从基底上分离，并且同时记录FD曲线。通过FD曲线能够获得最 大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通过高度自动化的控制系统能够在短时间内测量大量细胞粘附力，评估细胞群体分布以及细胞间差异，并且可有效避免传统粘附力测量因准备时间过长而错过最 佳测量时间导致的细胞粘附力改变，得到更为精 准的结果。

上次我们介绍了单颗粒ICP-MS 的原理，可以高分辨的检测到每个小至纳米尺寸的颗粒中的元素类型，颗粒尺寸，并可以统计样品中纳米颗粒的粒径分布。每个纳米颗粒产生一个脉冲峰，所得信号的强度同颗粒尺寸相关，脉冲数与颗粒浓度相关。这种技术基于超快速扫描时间的四级杆质量分析器，目前已经可以达到10µs 的采样时间，1 秒钟就能采集多达100000 个数据点。

利用单颗粒ICP-MS的快速采样时间的技术，搭配专用的进样系统，就可以分析每个细胞中的金属含量，称为单细胞ICP-MS。细胞逐个进入等离子体，被电离，内部金属产生的离子云被ICP-MS 检测。在单细胞ICP-MS 分析中，每个细胞被看做是一个单独的个体或粒子，可以产生自己的离子云。

准确地定量单个细胞的金属含量，可以更好的理解单个细胞对金属和/或含金属纳米颗粒的吸收和清除机制，含金属药物与细胞相互作用的机制，以及营养物质在细胞群中的分布。传统的测量细胞中金属含量的方法使用名义质量浓度，即假设金属在细胞间的分布是相等的，从而忽略了在单细胞水平上金属分布和变化的重要信息。

使用单细胞ICP-MS，我们可以获得以下信息

每个细胞的金属含量

细胞群的金属含量分布

含有金属或纳米颗粒的细胞浓度

每个细胞的纳米颗粒数量

将纳米颗粒设计为同时携带药物和成像探针的模式，以便同时检测和ZL癌症。还可将其设计为专门针对机体病变组织和细胞的模式。纳米颗粒相对传统小分子药物，具备以下优势（i）延长体内循环时间；（ii）减少非特异性细胞摄取、意外偏离目标和副作用；以及（iii）通过特定癌细胞靶向部分来提高细胞相互作用。很多基于纳米粒子的癌症疗法已获准在临床上使用和/ 或目前正在开发中。

金纳米颗粒AuNP

制备柠檬酸盐稳定剂的50 nmAuNP，并聚乙二醇化。

癌细胞

人类T24 膀胱癌细胞。在组织培养处理过的培养皿上采用McCoy 培养基（补充10% FBS），将细胞培养为单层细胞。

摄入实验

以每孔一百万个细胞的密度接种T24 癌细胞，并在37 ℃（5% CO2）的温度下培养24 小时，以确保细胞粘附在培养皿表面。然后，在浓度为0.4nM AuNP 的McCoy 培养基（补充10% FBS）中，让细胞和50 nm聚乙二醇化的AuNP 接触4 小时。形成Z终浓度为100,000 个细胞/mL 的单细胞悬浮液。

结论

结果表明，每个细胞吸收的AuNP 分布并不均匀，特定细胞群内的某些细胞比其他细胞明显摄取更多AuNP。SC-ICP-MS 是一个强大的分析工具，可在单个细胞水平上量化元素浓度和纳米粒子的分布。这项技术在单细胞基础上，具有提供的纳米粒子-细胞相互作用差异新见解的潜力。

扫描二维码，即可下载珀金埃尔默使用单细胞ICP-MS 法定量癌症细胞对金纳米粒子的摄取率应用报告。

近日，2020年ZX癌症负担报告由世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）发布，报告对2020年度常见的癌症类型、导致死亡主要癌症类型以及未来的癌症发展趋势进行了全面的分析。

2020年最常见新发癌症类型及占比

　　
　　肿瘤研究领域是全世界的科研热点，随着对肿瘤研究的白热化，越来越多的科学家需要从肿瘤组织里来获得细胞，从而建立原代肿瘤细胞系、分选肿瘤干细胞或者其它细胞以进行下游的信号通路检测、药物试验、疾病发生等。在对肿瘤细胞的研究中，从肿瘤组织中获得细胞的DY步就是制备单细胞悬液。那么，细胞悬液制备一般原则是什么呢？

细胞悬液制备一般原则

　　
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　　从组织获得存活单细胞是一个复杂过程，目前市面上组织单细胞化的方法有采用机器处理或者人工处理方法,以上处理方法均存在处理时间长、细胞处于逆境状态时间长、 细胞得率低、细胞存活率低、操作繁琐等问题。单细胞悬液仪结合特定组织松解剂，快速、轻柔、安全、简捷、GX、自动化的从组织如（脂肪、骨骼肌、动脉血管内皮、心脏、肝脏、pi脏、肺泡、肾脏、脑、肿瘤）30min内全自动完成组织单细胞的解离。

操作流程

　　
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